国家质检总局科技计划项目(2013IK054)
- 作品数：8 被引量：25H指数：3
- 相关作者：张永宁吴绍强林祥梅吕继洲冯春燕更多>>
- 相关机构：中国检验检疫科学研究院山东农业大学河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目国家科技支撑计划中国检验检疫科学研究院基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析被引量：7
- 2014年
- 目的制备施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(mAb)并分析其特性。方法将SBV N基因分别构建至pET-28a-c(+)和pMAL-c5X载体中,在大肠杆菌中诱导表达带组氨酸标签的融合蛋白His-SBV-N和带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白MBP-SBV-N,分别用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂和直链淀粉树脂纯化两种蛋白;用纯化的His-SBVN免疫BALB/c小鼠制备mAb,以MBP-SBV-N为包被抗原间接ELISA筛选分泌mAb的杂交瘤细胞和测定mAb效价,利用蛋白G琼脂糖凝胶从腹水中纯化mAb;应用Western blot和间接免疫荧光分析mAb的反应性和特异性。结果筛选并纯化出1株抗SBV的mAb(命名为1F2),效价为1∶32 000,重链亚型为IgG2α,轻链为κ;1F2既能与重组SBV N蛋白发生反应,又能识别SBV,但与布尼亚病毒科内亲缘关系较近的沙门达病毒、道格拉斯病毒和赤羽病病毒的N蛋白存在交叉反应,而与裂谷热病毒N蛋白无交叉反应。结论成功制备了抗SBV核衣壳蛋白的mAb,为SBV的血清学检测提供了工具。
- 张永宁吴绍强Kerstin WERNIKE吕继洲冯春燕林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白原核表达单克隆抗体
- 施马伦贝格病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用
- 2015年
- 依据施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)S基因保守序列,设计了特异性引物和MGB荧光探针,建立了SBV实时荧光RT-PCR检测方法,构建标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性等试验评价,并对绵羊和牛全血样品进行了检测。结果表明,所建立的SBV检测方法模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.998;特异性强,仅对SBV RNA出现特异性扩增曲线;灵敏度高,对SBV RNA的检测灵敏度为10copies;重复性好,重复检测灵敏度CV<3%;对临床样品的检测均为SBV阴性。所建立的SBV实时荧光RT-PCR方法可以为SBV的诊断和流行病学调查提供一种快速、特异、敏感的检测手段。
- 王建昌王金凤段永生张永宁李静
- 关键词：施马伦贝格病毒S基因
- 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立被引量：3
- 2015年
- 为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。
- 张永宁吴绍强宋姗姗董宣林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白慢病毒载体
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备被引量：1
- 2016年
- 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac^(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。
- 张永宁宋姗姗吴绍强林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白昆虫细胞单克隆抗体
- 检测施马伦贝格病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法被引量：2
- 2014年
- 根据施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)S基因节段设计一对引物和TaqMan探针,建立了检测SBV核酸的荧光定量RT-PCR方法。通过优化反应体系和反应条件,该方法对101~107半数组织培养感染量(TCID50)的SBV核酸呈现良好的线性关系。利用德国FLI制备和保存的SBV核酸阳性(n=140)、SBV核酸阴性(n=132)和辛波血清群相关病毒核酸样品(n=16),对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果表明,所建立方法与FLI研制的SBV荧光定量RT-PCR具有相近的敏感性,两者对140份SBV核酸阳性样品的检测符合率达96.4%(135/140);可灵敏地检测出1TCID50的SBV RNA,并具有良好的重复性;除道格拉斯病毒(Douglas virus)外,与辛波血清群相关病毒核酸无交叉反应。用该方法对采自内蒙古呼和浩特市某养殖场的绵羊血清(n=47)和澳大利亚进口绵羊血清(n=47)的RNA进行了检测,结果未发现SBV核酸阳性样品。SBV荧光定量RTPCR检测方法的建立为应对施马伦贝格病提供了有效的检测手段。
- 张永宁吴绍强吕继洲冯春燕王彩霞邓俊花袁向芬林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核酸引物TAQMAN探针荧光定量RT-PCR
- 施马伦贝格病研究进展被引量：8
- 2014年
- 施马伦贝格病是自2011年夏季以来在欧洲新发的一种虫媒性病毒病,其病原为施马伦贝格病毒,主要感染绵羊、牛和山羊等反刍动物,可导致成年家畜生产性能下降,怀孕母畜发生流产、产死胎或畸形胎儿。截至目前,中国尚未出现相关疫情。笔者将从病原学、流行病学、临床症状、发病机制与病理变化、检疫与诊断、预警与防控等方面对取得的最新研究进展进行概述,以期增强人们对该病的认识,并为中国有关部门采取恰当的防控措施提供科学依据。
- 张永宁吴绍强林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒检疫
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：11
- 2013年
- 本研究旨在表达施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的核衣壳蛋白(N),进而制备其多克隆抗体。以SBV(BH80株)的RNA为模板,RT-PCR扩增N基因序列,并将其克隆至原核表达载体pET-28a-c(+)中,获得pET-28a-SBV-N重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HisSBV-N融合蛋白。在非变性条件下用Ni-NTA柱纯化His-SBV-N,并以此为抗原免疫新西兰大白兔制备多抗。经免疫亲和层析纯化后,利用Western blot和间接免疫荧光对多抗进行鉴定。结果表明:(1)His-SBV-N融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中同时以可溶性和包涵体2种形式表达,相对分子质量约为30ku;(2)制备的多抗效价高达1∶64 000。该多抗不仅能与His-SBV-N融合蛋白发生特异性反应,而且还能识别SBV的不同毒株,但与布尼亚病毒科内亲缘关系最近的沙门达病毒(Shamonda virus)、道格拉斯病毒(Douglas virus)和赤羽病病毒(Akabane virus)的核衣壳蛋白存在交叉反应。His-SBV-N融合蛋白及其多抗的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立奠定了物质基础。
- 张永宁吴绍强吕继洲冯春燕王彩霞袁向芬邓俊花林祥梅Wernike Kerstin
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白原核表达多克隆抗体
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与纯化
- 2016年
- 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白,在SBV-N蛋白编码基因的N端引入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签编码序列,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac 1中构建重组供体质粒pFastBac-GST-SBV-N;经测序鉴定后,将pFastBac-GST-SBV-N转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使其与DH10Bac内含有的杆状病毒穿梭载体(杆粒)进行位点特异性转座,形成重组杆粒Bacmid-GST-SBV-N;抽提重组杆粒,转染Sf9昆虫细胞制备表达GST-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒rBac-GST-SBV-N;利用间接免疫荧光试验检测rBac-GST-SBV-N感染的Sf9细胞与SBV抗血清的反应情况。结果表明,rBac-GST-SBV-N感染的Sf9细胞能够与SBV抗血清发生特异性反应。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化Sf9细胞内表达的GST-SBV-N融合蛋白,借助Pre Scission蛋白酶切除GST标签后,对重组SBV-N蛋白进行Western-blot鉴定和间接ELISA分析。结果显示,在分子质量约为26 ku处出现一条特异性条带,其大小与SBV-N蛋白相符;该蛋白与抗SBV-N蛋白单克隆抗体2C8和SBV抗血清均能发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的反应原性。SBV-N真核表达蛋白的成功制备和纯化,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了诊断抗原。
- 宋姗姗张永宁吴绍强林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白昆虫细胞蛋白纯化
