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大豆查尔酮还原酶GmCHR基因的克隆及其在烟草中的表达被引量：8: 2014年; 以大豆品种"吉农28"为材料,利用RT-PCR技术获得GmCHR基因序列,并选择其中918 bp的开放阅读框,以pBI121为基础载体,构建了由35S启动子驱动的GmCHR植物表达载体,转入烟草中并对17株抗卡那霉素的转基因烟草进行PCR、GUS染色、Southern杂交检测,对植株中GmCHR基因mRNA表达量进行荧光定量PCR检测,采用高效液相色谱技术测定转基因植株中查尔酮还原酶催化产物异甘草素的含量。结果表明:GmCHR基因成功整合到烟草基因组中并能够成功表达;在转基因植株中目的基因的mRNA均有表达,且不同植株间表达量存在差异;转化烟草叶部组织中异甘草素的平均含量为(7.528±0.018)μmol/g,而转空载体烟草中未检测出异甘草素。; 魏洪波王丕武张卓刘强曲静李丹; 关键词：大豆基因克隆烟草

大豆查尔酮还原酶基因(Gmchr4)的克隆与功能鉴定被引量：2: 2014年; 大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是大豆苷元合成途径中必需的关键酶之一。在大豆基因组中分离到新的查尔酮还原酶基因Gmchr4,克隆基因cDNA片段长度为1 410bp(Gen Bank登录号:KF938604),含开发阅读框966bp,分析了Gmchr4在大豆基因组的进化关系。通过实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)和高效液相色谱技术(HPLC)分析了基因的表达水平和催化产物异甘草素的含量。实验结果证明得到一种新的大豆查尔酮还原酶蛋白基因,为深入探索大豆苷元等异黄酮类化合物的生物合成途径,尤其是相关基因间的表达调控提供了参考。; 张卓刘振库黄卓马建姚丹曲静王丕武; 关键词：大豆异黄酮大豆苷元异甘草素

大豆查尔酮还原酶基因CHR1的功能研究被引量：6: 2014年; 为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用,文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi,将载体转化受体大豆品种"吉农28"中,以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T0代阳性植株,13株T1代阳性植株。Southern blotting结果表明,功能元件以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。利用实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定CHR1基因在mRNA水平上的表达量,结果表明,转基因大豆植株中CHR1的表达量与未转化的受体大豆相比降低了60%～99%;高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测到合成大豆苷元过程中的前体物质异甘草素的含量降低了38.7%。该RNA干扰机制在转录水平上抑制了CHR1基因的表达。; 吴楠王丕武李丹代力强郑成忠卢实才源张卓曲静夏海丰; 关键词：大豆大豆苷元 RNA干扰载体

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达被引量：2: 2012年; 采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。; 付永平宋冰王丕武卢实; 关键词：绿色木霉纤维素酶粟酒裂殖酵母酶活力

大豆查尔酮还原酶3基因(chr3)的克隆及体外催化活性分析被引量：2: 2015年; 【目的】克隆大豆查尔酮还原酶3基因(chr3),并分析其编码蛋白体外催化活性,为研究大豆苷元的合成与调控研究提供参考。【方法】以大豆品种"吉农17"为材料,采用RACE技术扩增大豆chr3基因,对其编码蛋白的结构和功能位点进行分析。将目的基因chr3连接到大肠杆菌载体pET28a上,然后转化到大肠杆菌BL21中,构建重组大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3,并通过高效液相色谱技术(HPLC)验证重组蛋白的催化性质及效率。【结果】成功克隆chr3基因,其全长序列长1 416bp(GenBank登录号:KF927169),成功构建了大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3。HPLC检测结果表明,重组蛋白CHR3催化合成了异甘草素,使大豆异甘草素含量提高到了33.673μmol/g。【结论】分离鉴定了大豆chr3,其编码蛋白CHR3催化活性明显提高。; 张超王丕武张卓; 关键词：大豆大豆苷元基因克隆

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析被引量：1: 2012年; 【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。; 付永平李博王丕武高玮夏海丰张卓; 关键词：绿色木霉 Β-葡萄糖苷酶粟酒裂殖酵母酶学活性

拟南芥CBF4基因启动子缺失载体的构建及转化被引量：1: 2013年; 利用PCR方法,从拟南芥基因组中克隆脱水响应因子CBF4基因启动子全序列4A(1 260 bp)及两段不同长度5′缺失片段4B(565 bp)和4C(470 bp),通过亚克隆构建含有该系列启动子的可溶性绿色荧光蛋白基因(smGFP)的植物表达载体p1301-4A-GFP、p1301-4B-GFP、p1301-4C-GFP,用农杆菌介导烟草叶盘法分别导入烟草。20%PEG6000模拟干旱诱导转基因植株,检测转基因烟草转入不同启动子片段烟草植株诱导前后叶片GFP的表达强度。在倒置荧光显微镜和384 nm紫外灯照射下检测到的全片段4A与5′缺失片段4B和4C转化植株均显荧光,且随启动子长度的变短,荧光强度逐渐增强。基本确定了启动子的核心区域为4C(470 bp)。; 孙靖然王丕武马建; 关键词：拟南芥绿色荧光蛋白

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国家自然科学基金(31171568)