国家科技重大专项(2012ZX10004-210-004)
- 作品数：10 被引量：47H指数：4
- 相关作者：彭海燕史智扬迟莹焦永军张黎更多>>
- 相关机构：江苏省疾病预防控制中心南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达被引量：4
- 2014年
- 目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。
- 单云峰李燕迟莹卞倩
- 关键词：H5N1禽流感病毒真核表达克隆
- 慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立被引量：1
- 2014年
- 目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。
- 张黎彭海燕周明浩余慧燕曾晓燕祁贤崔仑标焦永军史智扬
- 关键词：血凝素基因慢病毒载体真核表达系统
- H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达被引量：1
- 2013年
- 目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。
- 温恬迟莹张黎张文帅彭海燕史智扬
- 关键词：NS1真核表达免疫印迹
- 2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查被引量：3
- 2015年
- 目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。
- 彭海燕崔岚崔仑标胡建利鲍倡俊李燕焦永军卞倩史智扬周明浩
- 关键词：实时荧光RT-PCR宿主媒介
- 抗体组库技术研究进展被引量：2
- 2014年
- 抗体组库技术主要用于研究免疫系统中B细胞编码的全部抗体信息,经历了B细胞Sanger测序、抗体分子质谱分析和高通量测序等3个发展阶段,该技术的发展正不断改变人们的传统认知。高通量测序技术使抗体组库容量不断提高,偏差不断减小;而分析软件的不断更新大大提高了在海量数据中发现低拷贝数稀有序列和其他相关生物信息的可能性。抗体组库技术可用于快速制备特异性人源抗体,B细胞源性恶性肿瘤和自身免疫性疾病的早期诊断、治疗效果评价、病情监测,感染性病原致病机理的研究,以及疫苗的研发和优化。它为科学家打开了一个窥视免疫系统的窗口,使人们能够从生物信息学的角度去理解疾病与健康的关系。
- 张黎史智扬
- 关键词：高通量测序
- H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达被引量：1
- 2014年
- 目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。
- 张文帅张黎温恬迟莹黄超彭海燕焦永军史智扬
- 关键词：原核表达
- 2016年江苏省沙门氏菌血清型的分布、耐药状况及相关基因研究被引量：25
- 2018年
- 目的:研究江苏省食源性疾病监测中沙门氏菌血清型的分布状况、抗菌药物耐受性和相关基因的突变情况。更好地了解江苏省沙门氏菌耐药性的产生和特点,确保食品安全。方法:用食品安全国家标准方法对菌种进行复核鉴定和血清分型。沙门氏菌药敏性的测定使用美国临床和实验室标准协会推荐的肉汤稀释法,用PCR和基因序列测定方法确定沙门氏菌中耐喹诺酮类药物的gyr A、gyr B、par C、par E基因及其突变状况。结果:全省疾病监测沙门氏菌检出率为3.29%。其中主要的血清型为肠炎沙门氏菌(23.4%)、鼠伤寒沙门氏菌(15.1%)、拉古什沙门氏菌(8.3%)、布利丹沙门氏菌(5.2%)等。沙门氏菌主要耐受的抗生素包括:红霉素(100.0%)、氨苄西林(68.8%)、四环素及萘啶酸(52.6%)。沙门氏菌多重耐药率达64.7%,最多耐受8类抗菌药物。耐萘啶酸沙门氏菌gyr A基因在Ser83位或Asp87位密码子处发生突变,gyr B、par C和par E未发现突变。结论:江苏省食源性疾病监测中沙门氏菌的耐药状况严重,血清型分布与其他省份存在差异,喹诺酮类耐药基因gyr A基因突变是导致沙门氏菌耐药的重要机制。
- 沈赟秦思唐震
- 关键词：沙门氏菌血清分型耐药基因
- 高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定被引量：5
- 2014年
- 目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。
- 彭海燕迟莹李燕卞倩
- 关键词：核蛋白克隆真核表达
- 羊及其体表蜱中SFTSV的分离培养与全基因序列分析被引量：6
- 2013年
- 目的 调查2012年春季江苏省某县羊及其体表蜱中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染情况,并对分离到的毒株进行全基因序列分析.方法 采用荧光定量RT-PCR法对标本进行SFTSV核酸检测,所有阳性标本进行病毒分离并测序,序列结果用Lasergene和MEGA4软件进行拼接和分析.结果 7只羊和从羊体上采集的93只长角血蜱中,1只羊的血清和淋巴结SFTSV核酸检测呈阳性,附着于该羊体表的1只长角血蜱病毒核酸也呈阳性,通过病毒分离获得2株SFTSV毒株,JS2012-yang01（羊）和JS2012-pi01（蜱）.序列分析结果显示,JS2012-yang01和JS2012-pi01的L、M和S基因片段的核苷酸同源性分别为99.8％ 、99.8％ 、100.0％,氨基酸同源性分别为99.6％ 、99.6％、100.0％,进化树分析显示两株病毒处于同一亚分支.2株毒株与中国其他地区流行的SFTSV毒株核苷酸序列同源性介于95.9％～～ 99.6％（L基因）,94.7％～～99.5％（M基因）和95.0％～99.5％（S基因）,与布尼亚病毒科白蛉病毒属其他毒株序列差异较大.结论 该调查中分离自羊和蜱的SFTSV高度同源.蜱虫通过叮咬吸血,可能在SFTSV从动物到人的传播过程中起媒介作用.
- 吴涛郭喜玲彭海燕陈银赵康辰崔仑标葛以跃史智扬祁贤刘大鹏焦永军
- A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展被引量：3
- 2014年
- A型流感病毒引起的疾病主要包括猪流感、禽流感、人类流感等,主要通过飞沫传播,可引起全身肌肉酸痛、疲倦无力、厌食,并可能引发病毒性肺炎。高致病性禽流感感染还可能引发严重的并发症,包括广泛的肺水肿、急性呼吸窘迫综合症、以肾和心脏功能失调为代表的多器官功能衰竭,病死率极高。
- 金鑫迟莹苏川
- 关键词：A型流感病毒禽流感猪流感毒力凋亡
