国家自然科学基金(31140093)
- 作品数：4 被引量：13H指数：2
- 相关作者：李秀锦仲飞李文艳张峰潘红丽更多>>
- 相关机构：燕山大学河北农业大学河北大学更多>>
- 发文基金：河北省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 单增李斯特菌对小鼠巨噬细胞炎性体的激活及其对滋养层细胞的免疫调节作用
- 试验目的:研究单增李斯特菌(LM)激活小鼠巨噬细胞的分子机制及其对小鼠滋养层细胞的免疫调节作用。试验方法:用野生型LM和溶血素(LLO)基因敲除的LM(LLO-/--LM)分别感染小鼠巨噬细胞系B6细胞和NLRP3-/-...
- 李文艳王利月林洪羽温洁霞张永红张建楼李秀锦黄河玲仲飞
- IL-2与IL-7基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用
- <正>试验目的:探讨犬白细胞介素-2(cIL-2)与犬IL-7(cIL-7)基因对犬细小病毒(CPV)VP2蛋白DNA疫苗免疫增强的协同作用。【方法】利用含内部核蛋白体进入位点(IRES)的真核表达载体构建cIL-2和c...
- 陈慧慧王利月林洪羽王永红张考李文艳温洁霞仲飞李秀锦
- 文献传递
- 重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞被引量：8
- 2012年
- 【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。
- 张峰仲飞李秀锦王幸兴张考陈慧慧李振李文艳潘红丽韩冬梅
- 关键词：抗病毒活性猪繁殖与呼吸综合征病毒真核表达
- 重组单增李斯特菌溶血素O在大肠杆菌中的分泌表达及活性分析被引量：2
- 2014年
- 单增李斯特菌是食源性致病菌,常引起人和动物的生殖障碍,由此菌分泌的溶血素O(LLO)是重要的致病因子。为研究LLO对细胞的毒性作用及对动物体生殖免疫的调节作用,需要制备大量重组LLO。为此本试验依据LLO基因序列(JN703918)通过PCR方法从单增李斯特菌菌株基因组中扩增无信号肽的LLO编码基因,然后将其插入到pET-20b(+)质粒中,使其5′端与载体中的pelB信号肽序列融合,3′端与His-标签融合,构建成LLO分泌性原核表达载体pET-20b-LLO/H。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LLO蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。利用溶血试验检测重组蛋白的生物活性。结果表明,本试验扩增的LLO基因序列与GenBank中的LLO基因序列完全一致。采用分泌性表达策略实现了重组LLO在大肠杆菌中的分泌表达,并且表达的重组LLO具有明显的溶血活性。
- 李文艳张永红林洪羽李秀锦仲飞
- 关键词：单增李斯特菌大肠杆菌分泌表达
- PRRSV囊膜GP5/M双基因表达载体的构建
- 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害养猪业发展最严重的传染病之一,目前由于缺乏有效的疫苗未能得到有效控制。已知PRRS病毒(PRRSV)主要感染猪的肺泡巨噬细胞(PAM),我们在研究猪天然防御活性物质时发现,肺泡表面活性...
- 陈慧慧王利月林洪羽王永红张考李文艳温洁霞仲飞李秀锦
- 重组猪IL-7在真核细胞的分泌表达及生物活性分析被引量：1
- 2013年
- 为了解猪IL-7(pIL-7)在防治猪免疫抑制性传染病及疫苗生物佐剂中的作用,通过RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出含有自身信号肽序列的pIL-7 cDNA基因,将其克隆到pcDNA3.1A表达载体上,构建出羧基端与Myc/His融合的pIL-7基因真核表达载体pcDNA3.1A-pIL-7/MH。由磷酸钙介导将pcDNA3.1A-pIL-7/MH质粒转染人类胚胎肾细胞293T(HEK293T)使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的pIL-7基因表达载体是否可介导重组pIL-7在真核细胞中进行分泌型表达。然后利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化表达的重组pIL-7,并通过淋巴细胞增殖试验检测其的生物活性。结果表明,扩增的pIL-7基因序列与GenBank序列完全一致;构建的表达载体可介导重组pIL-7在真核细胞HEK293T中进行分泌型表达。表达的重组pIL-7对猪脾淋巴细胞有明显的促增殖效应。由此可见,利用真核细胞表达的重组pIL-7具有生物活性。
- 温洁霞林洪羽王利月李文艳张考陈慧慧仲飞李秀锦
- 关键词：真核表达
- 小鼠腮腺组织特异性表达黄曲霉毒素解毒酶的研究
- <正>黄曲霉毒素具有很强的急性毒性,可导致肝脏坏死出血,免疫系统受损,并具有致癌、致畸和致突变作用,严重危害人和畜禽健康。采用转基因技术方法消除黄曲霉毒素的研究鲜见报道。本研究将来源于假蜜环菌的黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ...
- 关立增孙育平蔡锦顺吴汉东于龙政张永亮习欠云
- 文献传递
- 猪PRRSV受体唾液酸黏附素多克隆抗体的制备被引量：2
- 2013年
- 唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的主要受体,研究该受体在PRRSV感染过程中的作用依赖于特异的抗体。为制备Sn的抗体,首先依据通过DNAstar软件分析的抗原指数,确定编码114个氨基酸的Sn抗原表位基因(Sn114),然后依据大肠杆菌偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并由人工合成该基因。将合成的基因克隆到pET-32a(+)质粒中构建成与硫氧还蛋白(Trx)和6×His融合的Sn114基因原核表达载体,将表达载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG的诱导下使其表达。利用Ni-NTA琼脂糖分离纯化表达的Sn114融合蛋白,再用Sn114融合蛋白免疫家兔,通过ELISA方法检测免疫后家兔血清的抗体滴度,并通过Westernblot和细胞结合试验检测抗体的特异性。结果表明,本试验构建的Sn114表达载体能够介导Sn114融合基因在大肠杆菌中进行高效表达,表达量为63mg/L;用纯化后的Sn114蛋白免疫家兔,免疫后34d抗体滴度为1∶10 240。抗体特异性检测结果表明,所制备的Sn抗体能与猪肺泡巨噬细胞的Sn抗原进行特异性免疫反应。
- 李振仲飞李秀锦王幸兴韩冬梅张峰潘红丽王璐孙岩贾启恒
- 关键词：密码子优化多克隆抗体PRRSV
