国家自然科学基金(30800997)
- 作品数：11 被引量：45H指数：4
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- 相关机构：苏州大学苏州大学附属第二医院苏州市红十字中心血站更多>>
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- 一株新型鼠抗人PD-L2单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定
- 2011年
- 为了研制特异性识别人PD-L2(B7-DC,CD273)的鼠单克隆抗体,并对其生物学特性和PD-L2分子的表达特性进行初步分析。以高表达人PD-L2分子的基因转染细胞L929/PD-L2作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L2作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Western blot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验对单抗进行生物学特性的分析,继而利用该单抗进行免疫荧光标记和流式细胞术检测PD-L2在肿瘤细胞株和免疫细胞上的表达特性。结果显示,通过多次融合和反复筛选,成功获得一株特异性鼠抗人PD-L2(B7-DC)的杂交瘤,该杂交瘤分泌的单克隆抗体能特异识别人PD-L2分子。继而利用上述研制获得的单克隆抗体8F2进行免疫荧光标记和流式细胞术检测发现,PD-L2上调性表达在成熟的树突状细胞和调节性T细胞上。提示,成功地获得一株特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体,并对其生物学特性和表达谱进行初步分析,证明其识别抗原表位不同于商品化抗体,是一株新型鼠抗人PD-L2单抗,这为进一步研究PD-1/PD-L2信号通路在免疫应答中的生物学作用提供了有价值的物质基础。
- 白利雄陈永井周莹张雪琨马钰张学光
- 关键词：协同刺激分子单克隆抗体PD-L2PD-1
- 肺癌患者外周血中可溶性程序性死亡配体-1的表达及其临床意义被引量：16
- 2012年
- 目的 检测肺癌患者血清中可溶性程序性死亡配体-1 （sPD-L1）的表达水平,探讨其生物学及临床意义.方法 收集2009年6月至2011年3月苏州大学附属第二医院呼吸科收治的肺癌患者81例,男55例,女26例,年龄34 ～ 87岁,平均（65±6）岁.所有肺癌患者均为初诊且经组织或细胞病理学确诊；同时选择88名性别、年龄匹配的健康志愿者作为对照组.采用Western blot方法和酶联免疫吸附方法（ELISA）检测上述人员血清中sPD-L1的表达水平,流式细胞术检测淋巴细胞亚群的变化.结果 肺癌患者外周血中sPD-L1平均水平为1.6（0.7～7.8） μg/L,明显高于健康人的0.9（0.4～3.7） μg/L（P＜0.001）；肺癌患者血清中sPD-L1的高表达与有无远处转移及转移程度密切相关（x2=5.636,P＜0.05；x2=4.601,P＜0.05）.治疗后达客观缓解的患者,治疗前后血清中sPD-L1的含量分别为2.7（1.6～7.0） μg/L和1.1（0.8～1.7） μg/L（P＜0.01）；病情进展的患者治疗后sPD-L1含量为1.9（1.3～8.5） μg/L,比治疗前的1.4（0.8～2.2） μg/L明显升高（P＜0.01）.肺癌患者外周血中T细胞和B细胞亚群也呈异常改变,其中CD8＋T细胞数量显著减少（P＜0.05）,CD4/CD8比值显著升高（P＜0.05）,进一步行双标检测发现T细胞亚群中CD4＋ PD-1＋及CD8＋PD-1＋百分率均增高（P＜0.05）.结论 肺癌患者外周血清中sPD-L1的表达异常增高,且与肺癌的分期、转移和疗效有关,有助于判断肺癌患者的预后,可能成为重要的抗肿瘤靶点或分子标记物.
- 邢玉斐张增利施敏骅马钰陈永井
- 关键词：肺肿瘤程序性死亡配体-1
- PD-1／PD-L1抑制途径与自身免疫性糖尿病被引量：1
- 2011年
- PD-1（CD279）是一种负性协同刺激分子，属于CD28超家族成员，呈诱导性表达于活化的T、B和自然杀伤细胞表面。PD—L1（B7-H1，CD274）和PD—L2（B7-DC，CD273）是PD-1的两个配体。PD-1和PD—L1相互作用可以使活化的自身反应性T细胞获得负性信号，抑制其对自身抗原持续的免疫应答。若PD—1／PD—L1抑制途径缺失或被阻断，则导致自身反应性T细胞过度激活及增殖并引起自身组织的免疫损伤，进而引发多种自身免疫性疾病的临床表现。业已证明，自身免疫性糖尿病的发生、发展与PD-1／PD—L1抑制途径密切相关。阻断PD-1／PD—L1抑制途径，持续活化的胰岛自身反应性T细胞将损伤胰岛组织，致使胰岛p细胞分泌胰岛素功能受损，引起外周血糖显著升高，从而产生一系列病理变化。
- 杜宣施毕旻
- 关键词：PD-1自身免疫性疾病糖尿病
- 负性协同刺激分子PD-1在重症肌无力患者外周血中的表达被引量：4
- 2011年
- 目的 观察重症肌无力（MG）患者外周血中负性协同刺激分子programmed death-1（ PD-1）的表达情况，并探讨其与MG发病的关系。方法 采用免疫荧光标记、流式细胞仪检测45例MG患者和33名健康对照者外周血单个核细胞中PD-1及其配体PD-L1的表达，用ELISA法检测各组血浆中可溶性PD-1的水平。结果 （1）MG患者表达PD-1的CD4^＋T淋巴细胞比例增加，CD14^＋PD-L1^＋的单核细胞比例增加，但在不同性别及眼肌型与全身型间差异无统计学意义；在胸腺异常MG患者中CD4^＋PD-1^＋T细胞增加，CD14^＋ PD-L1^＋的单核细胞比例减少；早发型MG患者（年龄＜40岁）CD4^＋PD-1^＋T淋巴细胞比例明显低于晚发型（年龄≥40岁）。（2）MG患者血浆中sPD-1浓度为（6.92 ＋0.72） ng/ml，明显高于健康对照组的（3.28±0.42） ng/ml，但在性别、MG眼肌型与全身型不同类型间和有无胸腺异常各组间差异无统计学意义，且sPD-1与发病年龄呈负相关（r=-0.526，P=0.000）。结论 PD-1及PD-L1途径参与了MG的发病，异常升高的sPD-1可能干扰了正常的细胞膜上PD-1与PD-L1的结合，从而促使疾病进展。
- 薛群鲍民强蒋觉安陈永井薛利敏方琪王明元顾国浩董万利张学光
- 关键词：重症肌无力凋亡调节蛋白质类
- 2型糖尿病患者单核细胞表面PD-L1的表达及其生物学意义
- 2011年
- 目的探讨2型糖尿病(T2DM)合并血管病变患者外周单核细胞表面负性协同刺激分子程序性死亡配体-1(PD-L1)的表达变化及其生物学作用。方法应用流式细胞术分析单纯糖尿病组(42例)、糖尿病合并大血管病变组(48例)、糖尿病合并急性冠脉综合症组(35例)和健康对照组(48例)外周血中单核细胞表面PD-L1分子的表达水平,同时检测各T淋巴细胞亚群表面程序性死亡受体1(PD-1)的表达;采用ELISA法检测各组血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子浓度。结果与健康对照组相比,糖尿病三个组患者外周单核细胞表面PD-L1表达均显著增加(P<0.05),并与血管病变的严重程度呈正相关,而CD4+和CD8+T淋巴细胞表面PD-1受体的表达亦呈上调性表达(P<0.05)。随着血管病变的进展,糖尿病患者外周TNF-α和IFN-γ水平呈增加的趋势(P<0.05)。结论 T2DM患者外周单核细胞表面PD-L1表达上调在DM及合并大血管病变、急性冠脉综合症的发生和发展中发挥着一定的作用。
- 施毕旻杜宣陈永井张学光
- 关键词：程序性死亡配体-1程序性死亡受体-1
- 肺癌患者化疗前后外周血sPD-L1变化及其临床意义被引量：4
- 2013年
- 目的探讨肺癌患者化疗前后血清中可溶性程序性死亡配体1(sPD-L1)的表达变化及其临床意义。方法采用ELISA检测肺癌患者40例(肺癌组)、肺部良性疾病患者40例(良性组)和健康体检者40例(对照组)血清sPD-L1的动态变化,分析sPD-L1表达与TNM分期、功能状态(PS)评分、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及细胞角蛋白19血清片段211(CYFRA211)的相关性。结果肺癌组sPD-L1水平高于良性组和对照组(P<0.05和P<0.01)。达客观缓解的肺癌患者,化疗后血清sPD-L1水平比化疗前显著降低(P<0.01);疾病进展的肺癌患者化疗后sPD-L1水平比化疗前显著升高(P<0.01)。肺癌患者sPD-L1异常高表达与PS评分、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。血清sPD-L1表达与肿瘤标志物CEA、CYFRA211及NSE密切相关。结论肺癌患者外周血清sPD-L1的表达异常增高,且与肺癌的分期、转移和疗效密切相关。
- 王晓景施敏骅陈永井
- 关键词：肺癌
- 鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定被引量：3
- 2011年
- 目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。
- 周莹陈永井白利雄朱耿超王雪峰张学光
- 关键词：协同刺激分子单克隆抗体T细胞
- 外源性叶酸预处理影响培美曲塞对人肺腺癌A549细胞的体外杀伤作用被引量：4
- 2011年
- 目的体外研究培美曲塞对人肺腺癌A549细胞的生长抑制及诱导凋亡作用,观察外源性叶酸对这种抑制作用的影响。方法用不同浓度梯度（0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000μg/ml）培美曲塞作用于A549细胞,MTT法检测培美曲塞作用24 h后A549细胞的增殖能力;观察不同浓度（0、3、9、278、1 nmol/L）外源性叶酸预处理对培美曲塞细胞毒作用的影响;流式细胞术测定不同浓度梯度叶酸对培美曲塞诱导A549细胞凋亡作用的影响。结果培美曲塞作用24 h,随着其浓度在0.0001~0.1μg/ml之间递增,A549细胞组OD值随之减小（P〈0.05）;随着外源性叶酸浓度的增加,培美曲塞作用于A549细胞的IC50逐渐递增,且细胞凋亡率随外源性叶酸浓度增加而降低（P〈0.05）。结论在一定浓度范围内,培美曲塞对A549细胞的生长具有显著抑制作用;而补充外源性叶酸能够有效减弱培美曲塞对A549细胞的抑制和诱导凋亡作用。
- 施敏骅施敏骅陈永井
- 关键词：培美曲塞非小细胞肺癌叶酸
- 人PD-1Δex3基因的克隆、表达及其生物学活性的鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的:构建表达人PD-1Δex3(ΔPD-1)基因的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法:通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1Δex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得ΔPD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-1和pIRES2-EGFP/ΔPD-1并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入293T细胞;流式细胞术(FCM)检测转染细胞膜表面PD-1的表达;Western blot法检测培养上清中可溶性PD-1(sPD-1)的表达;间接免疫荧光实验分析ΔPD-1蛋白与PD-1两个配体PD-L1和PD-L2的结合。结果:酶切和测序结果均证实插入的基因序列正确,成功构建两个真核表达载体;FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无sPD-1蛋白,而ΔPD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1;间接免疫荧光实验结果表明,ΔPD-1蛋白能够与PD-1两种配体产生特异性结合。结论:成功进行PD-1Δex3基因的真核表达,证实PD-1Δex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1Δex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础。
- 胡振华陈永井王勤施毕旻白利雄张学光
- 关键词：协同刺激分子PD-1生物学活性
- α-硫辛酸对AGEs作用下血管内皮细胞PD-L1表达的影响被引量：4
- 2011年
- 目的探讨α-硫辛酸(LA)对糖基化终产物(AGEs)作用下的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)表面程序性死亡配体1(PD-L1)分子表达及培养上清液中可溶性PD-L1(sPD-L1)浓度的影响。方法实验分四组:正常对照组(C组:RPMI1640培养);糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)组[培养液分别为AGE-BSA50mg/ml(AG50组)、200mg/ml(AG200组)和400mg/ml(AG400组)];牛血清白蛋白(BSA)对照组[培养液分别为BSA50mg/ml(BG50组)、200mg/ml(BG200组)和400mg/ml(BG400组)];药物干预组[培养液分别为RPMI1640+200μmol/LLA(C+LA200组)、200mg/mlAGE-BSA+200μmol/LLA(AG200+LA200组)]。孵育72h后,检测各组HUVEC细胞表面PD-L1的表达及上清液中sPD-L1浓度的变化。结果不同浓度AGE-BSA作用细胞72h,PD-L1的表达及sPD-L1浓度较对照组显著升高(P<0.01),其效应呈现一定的浓度依赖性。在LA干预下,AG200+LA200组PD-L1表达及sPD-L1浓度显著低于AG200组(P<0.05)。结论 AGEs能有效上调内皮细胞表面PD-L1表达,并增加培养上清液中sPD-L1浓度;而LA则可抑制AGEs的诱导作用。
- 杜宣施毕旻陈永井张学光
- 关键词：Α-硫辛酸糖基化终产物
