国家自然科学基金(81171732)
- 作品数：15 被引量：57H指数：5
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- 丙戊酸钠对羰基氰化物间氯苯腙诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用研究
- 2023年
- 目的探讨丙戊酸钠(sodium valproic acid,VPA)对羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法新生SD大鼠10只,取颅骨采用组织块法分离培养成骨细胞并传代,对第1代细胞行ALP和茜素红染色鉴定。取第3代成骨细胞以2~18μmol/L CCCP分别培养2~18 min,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞成活率,并基于半抑制浓度原理选择合适浓度及培养时间用于制备成骨细胞氧化应激损伤模型;采用0~2.0 mmol/mL VPA培养12~72 h后,CCK-8检测细胞活性,选择合适浓度进行下一步处理。将第3代细胞随机分为4组,包括空白对照组(正常培养细胞)、CCCP组(参照选择的浓度及培养时间行CCCP处理)、VPA+CCCP组(参照选择的浓度及培养时间行VPA预处理+CCCP处理)、VPA+CCCP+ML385组(VPA预处理前用10μmol/L Nrf抑制剂ML385预处理2 h,其余处理方法同VPA+CCCP组)。上述处理完成后,取各组细胞检测氧化应激指标[活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)]、细胞凋亡率,并行ALP、茜素红染色,以及Western blot检测成骨相关蛋白(BMP-2、RUNX2)、抗凋亡家族蛋白(Bcl2)、凋亡核心蛋白[活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、Bax]、通道蛋白(Nrf2)相对表达量。结果经鉴定分离培养细胞为成骨细胞。根据CCK-8法检测结果,选择10μmol/L CCCP作用10 min建立成骨细胞氧化应激损伤模型,以及浓度0.8 mmol/mL VPA作用24 h进行后续实验。与空白对照组相比,CCCP组成骨细胞活性及矿化能力降低,ROS、MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,同时BMP-2、RUNX2、Bcl2蛋白相对表达量降低,Cleaved-Caspase-3、Nrf2和Bax蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);VPA+CCCP组进一步经VPA处理后,CCCP对成骨细胞的氧化应激损伤作用缓解,上述指标呈恢复趋
- 蒋文凯周志刘合栋任茂贤杨民
- 关键词：丙戊酸钠成骨细胞氧化应激骨质疏松
- 非创伤性硬膜外游离型颈椎间盘突出症的诊断和治疗被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨非创伤硬膜外游离型颈椎间盘突出症的临床特点和治疗方法。方法:自2002年1月至2011年7月采用颈前路椎体次全切除并后纵韧带切除髓核摘除减压内固定术治疗非创伤硬膜外游离型颈椎间盘突出症患者10例,其中男6例,女4例;年龄42～65岁,平均48.2岁;病程1个月～4年,平均15个月。所有患者术前有不同程度的四肢麻木、无力、行走不稳及括约肌功能障碍。术前颈椎MRI均提示有节段性颈脊髓受压。术前及术后随访时按JOA评分标准进行神经功能评分。结果:10例患者经术后15～32个月随访(平均21个月),无手术相关并发症发生。10例患者术前颈椎MRI显示,穿破后纵韧带游离于椎体后方的髓核在T1相上和相应病变椎间隙等信号,而在T2相上为等或高信号。患者术后JOA评分由术前的7.20±1.55提高到13.60±1.90(t=-11.8,P<0.001),其改善率为66.7﹪,优3例,良6例,可1例。结论:明确诊断后早期行前路椎体次全切除并后纵韧带切除髓核摘除减压内固定术是治疗非创伤硬膜外游离型颈椎间盘突出症成功的关键。
- 杨民丁国正徐祝军
- 关键词：硬膜外颈椎
- 褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用被引量：7
- 2022年
- 目的探讨褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用机制。方法取24 h内新生SD大鼠10只,采用组织块贴壁法提取原代成骨细胞并行差速贴壁提纯细胞。细胞传至第2代时行碱性磷酸酶及茜素红染色进行鉴定。将鉴定后的成骨细胞用不同浓度的H_(2)O_(2)作用不同时间并行CCK8试验检测细胞增殖情况。选择合适的浓度和时间建立氧化应激损伤模型,并用褪黑素及EX527进行干预。实验分为对照组、H_(2)O_(2)组、褪黑素组及EX527组。分别对四组细胞行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,检测四组细胞活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶含量,同时用流式细胞仪检测四组细胞凋亡率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和成骨相关蛋白BMP2、RUNX2以及SIRT1和p66SHC的表达量。结果经鉴定,成功提取原代成骨细胞。CCK8结果显示,400μmol/L H_(2)O_(2)作用4 h成骨细胞活性降至52%,适宜用于建立氧化应激损伤模型。H_(2)O_(2)作用后成骨细胞活性及矿化能力降低,ROS含量、MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,伴随有SIRT1、BMP2、RUNX2、Bcl2表达降低,p66SHC和Bax表达升高。褪黑素预处理后缓解了H_(2)O_(2)对成骨细胞的氧化应激损伤作用,部分恢复了成骨细胞的活性及矿化能力,SIRT1抑制剂EX527能够逆转褪黑素的上述作用。结论褪黑素通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞的氧化应激损伤并促进成骨。
- 刘合栋任茂贤李杨蒋文凯周志杨民
- 关键词：褪黑素成骨细胞氧化应激
- 缺氧复氧环境对成骨细胞自噬水平的影响被引量：6
- 2019年
- 目的探讨缺氧复氧环境对成骨细胞自噬水平的影响。方法取24~48h内新生SD大鼠的头盖骨,通过组织块贴壁法培养和差速离心法纯化成骨细胞,采用茜素红染色和碱性磷酸酶染色法对成骨细胞矿化钙结节及成骨细胞生物学特性进行鉴定。将第3代成骨细胞在正常状态下培养,并随机分为4组:A组在正常状态下培养36h;B组在正常状态下培养18h,再在缺氧状态下培养18h;C组在缺氧状态下培养36h;D组在缺氧状态下培养18h,再在正常状态下培养18h。培养结束后观察4组细胞形成矿化钙结节的能力,同时采用CCK-8法检测细胞增殖活性。随后采用定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)及成骨细胞特异性基因胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达。免疫蛋白印迹技术检测成骨细胞自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及自噬选择性底物P62蛋白的表达。组间数据比较采用单因素方差分析。结果4组成骨细胞培养18d后通过茜素红染色发现A组成骨细胞矿化钙结节能力最强,而B、C和D组矿化钙结节能力明显降低,且D组最低。CCK-8检测各组成骨细胞增殖活性发现,A组为98%±8%,B组为90%±8%,C组为82%±9%,D组为76%±8%,各组间差异有统计学意义(F=35.764,P=0.000)。RT-PCR结果显示Beclin1、LC3-ⅡmRNA的表达量各组逐渐增高,且D组>C组>B组>A组(F=38.327、16.583,均P<0.05);COL-Ⅰ、BMP-2mRNA的表达量逐渐降低,且A组>B组>C组>D组(F=20.387、12.426,均P<0.05)。免疫蛋白印迹结果显示各组Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量逐渐增高,且D组>C组>B组>A组(F=26.843、28.576,均P<0.05),P62蛋白表达逐渐降低,且A组>B组>C组>D组(F=18.946,P=0.011)。结论缺氧复氧环境会降低成骨细胞增殖活性,诱导上调成骨细胞自噬相关基因的表达。缺氧复氧环境在一定时间范围内会促进成骨细胞自噬水平的增加。
- 张俊宇何鹏杰程傲郑伟伟杨民
- 关键词：成骨细胞自噬缺氧复氧细胞增殖
- p22phox和NOX5在缺氧诱导成骨细胞自噬及凋亡中的作用研究被引量：1
- 2021年
- 目的探讨p22phox和NOX5在缺氧诱导成骨细胞自噬和凋亡中的作用。方法将新生大鼠颅骨组织剪碎,采用组织块贴壁法及差速贴壁法分离纯化成骨细胞。取第1代细胞行HE、茜素红、ALP染色以及流式细胞仪鉴定。采用三气培养箱制备成骨细胞缺氧模型,于缺氧0、3、6、12、24 h时,采用Western blot检测p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ表达情况,流式细胞仪检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平以及细胞凋亡率,选取细胞内ROS水平最高时间点作为后续实验的缺氧时间点。将第1代成骨细胞分成正常组、si-p22phox缺氧处理组和si-NOX5缺氧处理组,行对应转染及缺氧处理后,采用RT-PCR检测si-p22phox和si-NOX5抑制效率。然后再将第1代成骨细胞分成正常组、si-NC缺氧处理组、si-p22phox缺氧处理组以及si-NOX5缺氧处理组,行对应转染及缺氧处理后,采用Western blot检测细胞p22phox、NOX5、自噬相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin)、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率和ROS水平。最后,将成骨细胞分成缺氧12 h组(缺氧组)和同时抑制si-p22phox及si-NOX5并缺氧12 h组(抑制+缺氧组),对应处理后免疫荧光染色观察Beclin及Bax表达。结果经鉴定,分离获得的细胞为成骨细胞。缺氧处理后,成骨细胞p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量以及细胞凋亡率均逐渐升高(P<0.05),ROS水平亦升高(P<0.05)且12 h达峰值;选择缺氧12 h模型进行后续实验。抑制p22phox基因不影响NOX5的表达,而抑制NOX5基因也不影响p22phox的表达;与单纯缺氧处理相比,抑制p22phox或NOX5基因表达后LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax蛋白相对表达量下降(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量增高(P<0.05),细胞凋亡率及ROS水平亦下降(P<0.05);同时抑制p22phox和NOX5基因表达后,免疫荧光染色见Beclin、Bax荧光较弱。结论抑制p22phox和NOX5基因表达可以降低缺氧条件下成骨细胞内ROS水平,同时降低细�
- 何鹏杰李杨张若天任茂贤刘和栋杨民
- 关键词：缺氧成骨细胞P22PHOX活性氧簇自噬凋亡
- 葛根素对成骨细胞增殖、分化的促进作用以及其在体内异位成骨的影响被引量：1
- 2016年
- 葛根素是一类从中药葛根中提取的异黄酮单体，属植物雌激素的一种，近年来不少学者证实其具有促进成骨细胞（OB）增殖和分化以及矿化的特性。本研究旨在探讨葛根素促进OB增殖、分化的最适浓度以及在体内对OB异位成骨的影响。
- 郑伟伟林程杨民
- 关键词：成骨细胞增殖体内异位成骨葛根素分化植物雌激素异黄酮
- 退变性腰椎滑脱中腰椎-骨盆结构参数的特点分析被引量：5
- 2020年
- 目的:分析退变性腰椎滑脱(degenerative lumbar spondylolisthesis,DLS)中腰椎-骨盆结构特点及其在退变性腰椎滑脱症中的意义。方法:对2015年4月至2017年1月收治的45例单纯退行性L4,5节段腰椎滑脱患者(滑脱组)的临床资料进行回顾性分析,并与同期50例(对照组)体检资料齐全的健康者进行比较。通过影像学资料对受试者的腰椎-骨盆结构参数进行统计分析,分析DLS患者的脊柱-骨盆特点。观察退变性腰椎滑脱患者椎间盘及关节突关节退变特点。利用Spearson分析各观察项目之间的相关性。结果:滑脱组L4,5关节突关节角、腰椎前凸角、骨盆入射角、骨盆倾斜角、骶骨倾斜角为(36.5±11.2)°、(44.2±7.3)°、(66.5±11.6)°、(22.2±10.0)°、(33.4±11.3)°。对照组L4,5关节突关节角、腰椎前凸角、骨盆入射角、骨盆倾斜角、骶骨倾斜角为(44.4±8.2)°、(36.7±8.5)°、(55.4±13.2)°、(14.4±7.0)°、(42.3±13.1)°,滑脱组骨盆入射角、腰椎前凸角、骨盆倾斜角明显大于对照组(P<0.05),而关节突关节角、骶骨倾斜角小于对照组(P<0.05)。两组骨盆入射角与骨盆倾斜角、骶骨倾斜角之间有相关性(P<0.05),椎间盘退变与关节突关节之间存在相关性(P<0.05)。滑脱组L3-S1椎间盘及L4,5关节突关节退变更加严重。结论:腰椎-骨盆结构在退变性腰椎滑脱中发生了明显的变化。腰椎前凸及骨盆后倾现象在腰椎退变性滑脱身体代偿机制中有重要作用,腰椎关节突关节退变与腰椎间盘退变是相互促进的,腰椎滑脱加剧椎间盘与关节突关节退变。
- 周林杰杨民郑伟伟张俊宇
- 关键词：退变性腰椎滑脱椎间盘退行性变关节突关节
- 骨髓间质干细胞和脂肪间质干细胞混合培养后的成骨能力被引量：5
- 2016年
- 目的探讨骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem ceils, B MSC）和脂肪间质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC）混合培养后的成骨分化能力。方法以贴壁法和酶消化法获得BMSC和ADSC，用流式细胞术鉴定细胞表型；对两种细胞进行成脂肪、成软骨、成骨诱导，分别以油红“O”染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色进行鉴定；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素红染色鉴定成骨分化。取第3代BMSC和ADSC细胞加入成骨诱导液，根据不同处理方法分为四组：BMSC未诱导组、BMSC成骨诱导组、ADSC成骨诱导组、BMSC＋ADSC成骨诱导组。成骨诱导第1、3、5、7、9、11天检测ALP活性，第7、14、21、28天检测钙离子吸光度，第14天采用RT-PCR和Western Blot检测骨钙素（Osteocalcin，OCN）、Runx2蛋白的表达。将BMSC、ADSC或BMSC＋ADSC细胞植入羟基磷灰石，壳聚糖／聚乳酸（Hydroxylapatite／Chitosan／Poly L-latic acid，HA/CS/PLLA）支架材料，植入大鼠下肢骨缺损模型，术后8周取材检测复合材料的新骨形成面积。结果ADSC和BMSC两种细胞在成脂、成软骨、成骨诱导后染色均为阳性。诱导第1、3天，各组细胞ALP活性增加不明显，第5天以后活性开始明显增强，其中BMSC＋ADSC组高于其他三组。诱导第7天，各组细胞钙离子吸光度无明显变化，第14天开始逐渐增高，其中BMSC＋ADSC成骨诱导组高于其他三组。诱导第14天，BMSC＋ADSC成骨诱导组OCN和Runx2基因表达（分别为78．24±8．11，1180．13±121．16）和蛋白表达（分别为6．54±0．59，4．43±0．51）较其他三组升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。材料植入体内8周后，BMSC＋ADSC组有大量板状骨形成，支架材料基本降解完全，新骨形成面积为（497．75±7．44）μm2，明显大于其他三组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BMSC与ADSC两种细胞混合培养较单一细胞�
- 杨民郑伟伟林程
- 关键词：间质干细胞骨髓脂肪组织共同培养技术
- 缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析被引量：5
- 2020年
- 目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。
- 程傲何鹏杰张俊宇郑伟伟杨民
- 关键词：髓核细胞HIF-1Α自噬缺氧
- 富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨
- 2011年
- 背景:添加富血小板血浆可促进细胞体外成骨表型的快速转化,从而有效成骨。目的:观察富血小板血浆对脂肪间充质干细胞体内和体外成骨能力的影响。方法:第3代兔脂肪间充质干细胞进行成骨诱导培养,分为对照组和富血小板血浆组。细胞接种到钙磷陶瓷支架上后,体内外观察细胞/载体复合物的成骨情况。结果与结论:两组细胞随着诱导时间的延长碱性磷酸酶活性增高,达到高峰值后随后逐渐下降,诱导后14d时,富血小板血浆组即达到高峰值,对照组18d达到高峰值。细胞/载体复合体切片VonKossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状,有大量钙盐沉积。甲苯胺蓝染色显示载体的孔隙中可见成熟的骨质存在,周边区域较中心多。体外钙盐沉积对照组多,体内成骨面积富血小板血浆组多(P<0.05)。说明,富血小板血浆可有效诱导脂肪间充质干细胞体内和体外成骨。
- 杨民王剑王强
- 关键词：富血小板血浆脂肪间充质干细胞成骨诱导钙盐沉积
