国家自然科学基金(30972586)
- 作品数：6 被引量：6H指数：1
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- 相关机构：重庆医科大学附属第二医院重庆医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建被引量：1
- 2011年
- 旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。
- 刘娇周帆陈庆美单晓亮唐霓
- 关键词：穿梭质粒同源重组腺病毒
- 丙型肝炎病毒E1蛋白活化MAPK／ERK信号通路促进肝癌细胞增殖被引量：1
- 2012年
- 目的研究丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）编码蛋白E1的生物学功能。方法分别构建编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的腺病毒载体Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b；将重组并包装的腺病毒分别感染SMMC-7721细胞，测定感染滴度，通过RT—PCR方法在转录水平鉴定HCVE1、E2、NS3、NS5a、NSSb的表达，用Western印迹在蛋白水平鉴定E1蛋白的表达。腺病毒感染SMMC-7721细胞后，通过细胞增殖实验筛选生物学功能最明显的蛋白。将筛选到的Ad—E1感染SMMC-7721细胞，用MTS、结晶紫、细胞周期实验观察体外过表达E1蛋白对感染细胞增殖的影响；Western印迹检测p-ERK、ERK的表达；RT—PCR检测c—Myc、cyclinD1、c—Jun、c．Fos基因的表达。结果成功扩增了能够编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的高滴度腺病毒Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b，并且通过RT—PCR方法在转录水平鉴定了目的基因的表达，Western印迹方法在蛋白水平鉴定了E1蚩白的表达。通过细胞计数、MTS、结晶紫实验证实Ad—E1感染组细胞较对照组增殖速度加快，细胞周期显示Ad-E1感染组细胞34．38％处于S期，明显高于Ad—GFP（27．32％）（P〈0．05）对照组；Ad-E1感染绢p-ERK蛋白表达量增高，同时与细胞增殖相关的MAPK／ERK下游基因转录水平上凋。结论体外过表达HCVE1蛋白可以明显促进SMMC-7721细胞的增殖，其促增殖作用可能与MAPK／ERK信号通路的活化相关。
- 陈庆美刘娇单晓亮周帆权会琴陈林林唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒丝裂原活化蛋白激酶细胞增殖
- 骨形态发生蛋白和白血病抑制因子诱导肝干细胞分化被引量：1
- 2011年
- 目的在永生化的小鼠肝干（祖）细胞（HP）模型上筛选并优化高效的肝细胞定向分化诱导方法，探讨HP向肝细胞定向分化过程及分子机制。方法分别采用含人白血病抑制因子（LIF）、骨形态发生蛋白（BMP）2和BMP9基因的重组腺病毒感染HP，在病毒感染后第4天、第7天和第10天用糖原染色和吲哚花青绿（ICG）摄取实验观察HP的分化成熟度，并在第4、7、10、14天通过检测白蛋白启动子调控的荧光素酶报告基因活性，观察细胞合成白蛋白情况。计量资料比较用t检验。结果BMP2和BMP9对HP的诱导作用最强，荧光素酶活性、PAS染色和ICG摄取细胞阳性率随诱导时间的延长明显上升，在诱导后第7天最高，HP对BMP9的诱导应答最强，与对照组相比，酶活性增加了近9倍（t=17．30，P〈0．01），BMP2处理组增加了5倍（f=16．41，P〈0．01），LIF处理组增加了3倍（t=6．04，P〈0．01）。诱导第7天时，PAS染色细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为30％和45％；ICG细胞阳性率在BMP2和BMP9组分别为40％和30%。LIF诱导后，PAS染色、ICG摄取细胞阳性率以及荧光素酶活性有一定增加。结论BMP2、BMP9和LIF能够诱导HP向发育晚期肝细胞分化，并初步具备成熟肝细胞的一些功能。
- 高亚丽蔡雪飞刘娇单晓亮陈庆美周帆唐霓
- 关键词：干细胞细胞分化骨形态发生蛋白质类白血病抑制因子永生化
- 丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究被引量：1
- 2012年
- 旨在构建稳定表达HCV核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core并进行初步的生物学功能研究。利用PCR技术扩增HCV核心蛋白基因,通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB-3Flag中,将重组质粒pSEB-3F-Core和辅助质粒pAmpho共转染Huh7细胞,经过Blasticidine抗性筛选,建立稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core。采用RT-PCR、Western blot鉴定Huh7-Core细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS、结晶紫试验观察Huh7-Core稳定细胞株的增殖情况。结果显示,成功构建了表达HCV核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core。结晶紫、MTS试验证实Huh7-Core细胞较Huh7-3Flag细胞增殖速度增快,表达HCV核心蛋白的Huh7-Core稳定细胞株构建成功,Core稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度。
- 单晓亮刘娇陈庆美周帆陈林林权会琴唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白生物学功能
- 丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响被引量：2
- 2011年
- 目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路。方法将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR(MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达。结果在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P<0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P<0.05)。结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生。
- 陈庆美刘娇周帆单晓亮陈林林权会琴唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白甲基化
- 丙型肝炎病毒核心蛋白的研究进展
- 2011年
- 丙型肝炎是由HCV感染引起的传染性疾病，主要通过血液传播。超过70％的HCV感染者可发展为慢性肝炎、肝硬化，甚至肝细胞癌，但其发病机制不明确。目前的研究表明，HCV核心蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有致癌潜力，而且在HCV所致的慢性肝损伤如脂肪变性、肝硬化等病变中也有重要作用。本文就HCV核心蛋白的生物学功能及其致病机制的最新研究进展做一综述。
- 刘娇唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白HCV核心蛋白HCV感染慢性肝损伤血液传播慢性肝炎
