国家自然科学基金(81271417) 作品数:8 被引量:21 H指数:3 相关作者: 张莹 何金生 王荷 洪涛 齐志刚 更多>> 相关机构: 北京交通大学 中国疾病预防控制中心 中国医学科学院北京协和医学院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 国家科技重大专项 国家高技术研究发展计划 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 更多>>
重组人GSK-3β制备及tau磷酸化活性研究 2023年 目的:表达和纯化重组人糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β,GSK-3β),优化反应条件,分析GSK-3β对tau蛋白磷酸化修饰产物p-tau的生物活性。方法:构建GSK-3β原核和杆状病毒表达载体,镍亲和层析纯化,BCA法测定蛋白浓度,考马斯亮蓝染色分析纯度;免疫印迹(Western blot)鉴定GSK-3β免疫反应性;液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和斑点印迹检测GSK-3β的tau磷酸化情况;优化GSK-3β磷酸化体系中GSK-3β和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的浓度;负染透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)和硫磺素T(thioflavine-T,ThT)结合实验分析磷酸化产物形成纤维的情况;CCK8实验分析磷酸化产物的细胞毒性。结果:考马斯亮蓝染色显示,原核和杆状病毒表达的重组人GSK-3β蛋白表观分子量位于50 kDa左右,蛋白纯度分别为86%和81%;Western blot在相应位置有特异条带;LC-MS提示,经GSK-3β处理的tau蛋白有23个磷酸化位点;斑点印迹显示,兔抗pT181血清、兔抗pT217和pS404识别磷酸化的tau蛋白;优化反应条件,tau、GSK-3β和ATP的最适反应浓度分别为1μmol/L、5μmol/L和3.2 mmol/L;制备的GSK-3β对tau蛋白pT217位点磷酸化信号强于国外商品(P<0.05);TEM显示p-tau 5 d出现纤维结构,而tau未见明显的纤维结构;ThT结合实验检测到磷酸化产物的荧光值增强(P<0.05);磷酸化产物的细胞毒性增强(P<0.05)。结论:成功制备并鉴定了重组人GSK-3β,可催化tau蛋白在第181、217和404位氨基酸磷酸化,为阿尔茨海默病的基础研究提供了技术支撑。 刘振武 王荷 闫子迪 张莹 何金生阿尔茨海默病转基因小鼠脑内细胞因子动态水平分析研究 2019年 目的:天然免疫功能异常可能是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的重要致病机制之一。本文旨在研究AD小鼠小胶质细胞早期极化失调的动态水平。方法:用电化学发光(mesoscale discovery, MSD)方法检测AD双转基因小鼠APPswe/PS1?E9(APP/PS1)小胶质细胞活化相关多种细胞因子(TNF-?、IL-6、IL-1?、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-?、IL-2和IL-5)的动态变化水平,研究AD模型小鼠(APP/PS1)天然免疫调控与AD小鼠月龄增长之间变化的动态规律。结果:在小鼠脑组织中,随着小鼠年龄的增加(3 w、6 w、10 w、16 w、20 w和24 w),小胶质细胞炎症因子呈现一定的极化趋势。并且,与野生型相比,APP/PS1小鼠炎症因子TNF-?、IL-6、IL-1?呈现相反的变化趋势。检测10 w-16 w时段TNF-?,两组间差异显著(p<0.05)。10 w以上,与野生型(WT)相比,转基因(APP)组IFN-?上升明显(p<0.05)结论:综上,AD早期存在了增龄相关的小胶质细胞的活化,其机制值得进一步研究。 周子杨 杨贻然 李江弢 王荷 姜家龙 张莹关键词:阿尔茨海默病 天然免疫 细胞因子 电子显微镜技术—病毒结构与形态研究及快速诊断的基础平台 被引量:6 2013年 电子显微镜技术的优势在于微观测试的直观、快速与准确,因此成为新发传染病及生物反恐一线工作的重要平台基础.然而,全球电子显微镜诊断实验室的数量却在减少,并且越来越难以找到满意的途径来分析电子显微镜图像.加强病毒结构和形态发生学的研究在病毒的电子显微镜诊断应用中显得尤为重要.本文在分析技术优势的基础上,着重介绍了电子显微镜技术对病毒学发展的历史贡献、在病毒鉴别诊断中的作用、对特殊病毒抗原的定位、对病毒-宿主细胞的相互作用以及病毒形态发生学的研究,并指出,电子显微镜诊断是建立在结合临床资料以及光学显微镜和共聚焦显微镜综合数据基础之上的,避免操作不当造成的人工假象和错误结果是克服技术的局限性从而发挥其优势的重要保证. 张莹 洪涛 宋敬东 何金生关键词:电子显微镜技术 病毒结构 阿尔茨海默病免疫治疗:对攻克神经变性疾病的几点启示 被引量:5 2014年 阿尔茨海默病(AD)也称老年期痴呆,是老年人群高发的一种痴呆症,为临床常见的神经变性疾病,给社会和家庭带来巨大的经济负担和人文问题。临床常用的胆碱酯酶抑制药[多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rivastigmine)]和非竞争性N一甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体阻断药[美金刚(memantine)]均属于对症治疗,可短期缓解临床症状与体征, 张莹关键词:阿尔茨海默病 免疫系统 生物学标记 免疫疗法 TREM2与A192T突变在阿尔茨海默病进程中的作用研究 目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人中最常见的一种痴呆症,β淀粉样肽(Amyloidβ-peptide,Aβ)的异常聚集和AD的发病密切相关。研究表明2型髓样细胞触发受体(Trigg... 李江弢关键词:阿尔茨海默病 小胶质细胞 Β-淀粉样蛋白 阿尔茨海默病早期诊断:影像学和体液生物标志物研究前沿和新动态 被引量:8 2012年 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种由多种因素引起的脑神经退变性疾病。由于尚无准确的早期诊断,常使AD患者错过早期治疗的时机,成为制约有效防控AD的瓶颈问题。近年来,AD体液和影像学生物标志物的研究为解决这一问题带来了新的希望,其中以包括脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中的β-淀粉样蛋白和tau的体液生物标志物以及淀粉样蛋白成像(amyloid positron emission tomography,amyloid PET)、葡萄糖代谢成像(fludeoxyglucose F 18injection,FDG-PET)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)获得的影像学生物标志物研究最为成熟。及时确诊临床前AD或无症状AD,将会为有效防控带来主动。本文涵盖了影像学、生物化学和分子生物学等方面AD核心生物标志物和潜在的候选生物标志物的研究进展,而外周体液标志物以及无创性检测方法是本领域的发展方向。 王军 张莹 郑妍鹏 王虹峥 李坤成 齐志刚 崔瑞雪关键词:生物标志物 CSF Β-淀粉样蛋白 FDG-PET Electron microscopy:essentials for viral structure,morphogenesis and rapid diagnosis 被引量:2 2013年 Electron microscopy(EM) should be used in the front line for detection of agents in emergencies and bioterrorism,on accounts of its speed and accuracy.However,the number of EM diagnostic laboratories has decreased considerably and an increasing number of people encounter difficulties with EM results.Therefore,the research on viral structure and morphology has become important in EM diagnostic practice.EM has several technological advantages,and should be a fundamental tool in clinical diagnosis of viruses,particularly when agents are unknown or unsuspected.In this article,we review the historical contribution of EM to virology,and its use in virus differentiation,localization of specific virus antigens,virus-cell interaction,and viral morphogenesis.It is essential that EM investigations are based on clinical and comprehensive pathogenesis data from light or confocal microscopy.Furthermore,avoidance of artifacts or false results is necessary to exploit fully the advantages while minimizing its limitations. ZHANG Ying HUNG Tao SONG JingDong HE JinSheng关键词:病毒结构 病毒形态 生物恐怖主义 重组人tau441 (P301S)蛋白表达纯化及生物学特性分析 2021年 目的初步了解重组人tau441(P301S)蛋白体外聚集、抗原性及免疫原性等生物学性质。方法原核表达带His标签的tau441(P301S)重组质粒,镍亲和层析纯化重组蛋白,BCA测定蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色确定蛋白的纯度;采用Western blot(WB)和负染透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)鉴定;间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测所得蛋白的抗原性;以重组蛋白免疫小鼠,检测免疫血清特异性抗体滴度来分析其免疫原性。结果所得重组人tau441(P301S)纯度为70%,WB显示在相对分子质量(Mr.×10^(3))64和更高相对分子质量处有特异性条带。TEM显示,tau441(P301S)呈絮状团块聚集,团状面积显著大于tau441野生型蛋白(t=6.439,P=0.003);4℃孵育9 d后,tau441(P301S)形成明显的纤维状结构。间接ELISA结果显示,tau441(P301S)能被tau单抗HT7(1∶80000)识别;小鼠免疫血清tau特异性抗体滴度达到1∶128000,且WB显示,免疫后血清识别阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)转基因小鼠脑裂解抽提物。结论重组人tau441(P301S)蛋白具有体外聚集性增强的特性但其抗原性和免疫原性未改变。 姜家龙 刘振武 王子奇 聂中梁 李培昀 王荷 张莹 何金生 洪涛关键词:阿尔茨海默病 微管相关蛋白 CTFβ表达纯化及生物学性质鉴定 2014年 目的 表达和纯化淀粉样前体蛋白(APP)的羧基末端水解片段CTFβ,并鉴定其生物学性质,为在阿尔茨海默病(AD)抗体筛选中的应用奠定基础.方法 以APP基因为模板,克隆CTFβ的基因并测序鉴定;将CTFβ基因克隆到表达载体pET-30a(+)上,构建重组表达质粒pET30a-CTFβ;转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行纯化,并用Western Blot和ELISA检测其免疫反应性,并初步探索其作为检测抗原的实验条件.结果 重组蛋白在大肠埃希菌中可溶性表达,Western Blot结果,用抗组氨酸标签抗体做为一抗,(10~25) ×103处显示与预计相对分子质量大小一致的条带;此外,在80×103以上的位置尚有较粗的蛋白条带.用抗Aβ的单抗进一步分析发现,(10~25) ×103及80×103以上的条带可以被抗Aβ(17-24)单抗4G8识别,而80×103以上的条带还可以被Aβ寡聚体单抗识别,说明表达产物还形成了高相对分子质量的聚集体,位于80×103以上.间接ELISA结果表明CTFβ用于AD抗体检测的最佳包被剂量是1 nv孔.结论 本研究成功表达和纯化了CTFβ,并鉴定了其单体和聚集体的免疫反应性,为其在AD检测中的应用提供实验依据. 宋琳琳 杨海强 张莹 何金生 古应彩 侯明旭 刘楠楠关键词:阿尔茨海默病 原核表达