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信号肽对酵母外源蛋白质分泌效率的影响被引量：11: 2010年; 根据酵母表达系统在表达外源蛋白方面的独特优势,利用酵母表达系统高效分泌并纯化具有生物学活性的蛋白质,已受到广泛关注。信号肽在蛋白质的分泌中起着重要作用,可引导蛋白分泌至胞外,大大提高蛋白的表达量,在工业化生产外源蛋白的纯化工艺方面具有重要意义。该文将从酵母表达系统中对信号肽的选择、改造、偏爱密码子和增强子的应用等几个方面进行优化的探讨,以提高蛋白质在酵母系统中的分泌效率。; 覃晓琳刘朝奇郑兰英; 关键词：酵母表达信号肽蛋白质

mPD-1/mPD-L1体外分子结合模型的建立被引量：2: 2010年; 目的建立小鼠PD-1/PD-L1(mPD-1/mPD-L1)体外分子结合模型,为研究PD-1/PD-L1生物学活性及建立高通量药物筛选分子模型奠定基础。方法重组质粒在原核细胞表达mPD-1和mPD-L1蛋白,利用亲和层析及切胶方法纯化相应蛋白;应用ELISA和GSTPull-down方法验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的结合活性;以Alamar blue法检测纯化mPD-1和mPD-L1蛋白混合物对混合淋巴细胞增殖的影响。结果SDS-PAGE和Western印迹结果显示原核表达的重组蛋白与预期基本一致,经过亲和层析和切胶、复性等方式获得了纯化的mPD-1和mPD-L1蛋白。ELISA和GSTpull-down结果表明,mPD-1和mPD-L1蛋白具有体外结合的活性。淋巴细胞增殖试验进一步说明两蛋白的结合可一定程度上降低单独蛋白对淋巴细胞增殖的影响(P<0.05)。结论利用原核细胞高效表达并纯化的mPD-1、mPD-L1蛋白成功建立体外mPD-1/mPD-L1分子结合模型,为高通量药物初筛奠定了基础。; 覃晓琳刘朝奇杨凡郑兰英; 关键词：分子模型淋巴细胞增殖

小鼠钙网蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备: 2011年; 钙网蛋白(calreticulin,CRT)是存在于哺乳动物细胞具有高度保守性和多种生物学活性的蛋白,为了更好的研究其生物学活性,本课题组通过PCR方法扩增CRT截短基因,将其克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经大肠杆菌表达并纯化CRT蛋白。以纯化的CRT蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆的CRT血清。进一步采用Western blot、ELISA、流式细胞术等技术对制备的抗体进行初步鉴定。结果显示:原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达CRT蛋白;获得多抗血清应用Western blot鉴定几种细胞株中CRT,流式细胞术检测CRT的外翻现象。因此我们得到结论——成功制备了CRT蛋白及其抗体,并有很好的特异性,能识别人鼠两种源性的CRT。; 汪龚泽刘朝奇杨建林聂纪芹; 关键词：钙网蛋白原核表达抗体制备

小鼠PD-1胞外区基因片段表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：1: 2010年; 目的:原核表达并纯化小鼠PD-1膜外区(以下简称mPD-1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法:原核表达质粒pGEX-4T-1/mPD-1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白的表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。利用蛋白质纯化仪纯化蛋白。使用纯化蛋白免疫日本大耳白兔3次后,分离抗血清,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过细胞免疫荧光方法(CIF)和FCM检测高表达PD-1全长基因的L929细胞。结果:诱导表达并纯化了GST-mPD-1重组蛋白,得到相对分子质量(Mr)约42000的mPD-1蛋白。纯化蛋白免疫动物后,产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶1562500)。CIF和FCM结果显示抗血清与L929细胞表面PD-1有高度的特异性结合活性。结论:成功获得高纯度的mPD-1重组蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的抗体,为将mPD-1蛋白及抗体用于PD-1的生物学研究及抗肿瘤治疗的实验研究奠定了基础。; 覃晓琳刘朝奇唐国慧金羽; 关键词：蛋白表达抗体免疫原性

PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型的建立及应用: 2011年; 目的通过构建重组的小鼠pcDNA3.1(+)-PD-L1质粒,并在真核细胞中进行高表达,建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型用于免疫调节药物的筛选。方法以RT-PCR方法扩增得到小鼠的PD-L1全长片段;以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1;脂质体转染到小鼠成纤维细胞(L929),通过G418筛选得到高表达PD-L1的稳定细胞株并经免疫荧光鉴定;用丝裂霉素处理过的PD-L1高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养;成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型之后向其中加入不同种类、不同浓度的天然产物提取物,并设复孔。结果通过Eco RI/Xho I双酶切及测序证实构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1正确。RT-PCR和免疫荧光方法鉴定重组质粒在L929细胞中高效表达,应用流式细胞术成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型,并筛选出阻断PD-L1活性的有效药物。结论获得了稳定高表达PD-L1的细胞,并且用于免疫调节的药物筛选,为免疫调节药物的筛选奠定了实验基础。; 王见之刘朝奇汪龚泽覃晓琳吕佰瑞; 关键词：PD-L1 真核表达小鼠脾淋巴细胞药物筛选

小鼠PDL-1胞外区基因表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：2: 2010年; 目的:原核表达并纯化小鼠PDL-1膜外区(以下简称mPDL-1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法:原核表达质粒pET28a(+)/mPDL-1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白的表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。利用切胶回收的方法纯化蛋白。使用纯化蛋白免疫日本大耳白兔3次后,分离抗血清,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过细胞免疫荧光方法(CIF)和流式细胞术(FCM)检测表达PDL-1基因的B16细胞。结果:诱导性表达并纯化了mPDL-1重组蛋白,得到相对分子质量(Mr)约30000的mPDL-1蛋白。纯化蛋白免疫动物后,产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶1562500)。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表面PDL-1有高度的特异性结合活性。结论:成功获得高纯度的mPDL-1重组蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的抗体,为将mPD-L1蛋白及抗体用于PDL-1的生物学研究及抗肿瘤治疗的实验研究奠定了基础。; 覃晓琳刘朝奇杨凡吕佰瑞李斌; 关键词：蛋白表达抗体免疫原性

干扰程序性死亡分子1及其配体信号通路的免疫治疗被引量：2: 2011年; 程序性死亡分子1(programmed death-1,PD1)及其配体(programmed death ligand,PDL)属于B7家族的共刺激分子,介导免疫反应的负性调节信号,在肿瘤发生、病毒感染以及自身免疫病中都发挥了特异性的调节作用。利用PD1/PDL1信号途径调节机体的免疫应答从而达到免疫治疗的目的,该文就此展开综述。; 汪龚泽刘朝奇; 关键词：免疫调节免疫治疗

PD-1/PD-L1与Treg细胞相关性的研究新进展被引量：5: 2010年; PD-1和PD-L属于B7家族的共刺激分子,介导免疫反应的负性调节信号。Treg细胞是一个具有免疫调节作用的T细胞亚群,在机体的免疫耐受和免疫稳定中具有重要作用。本文就PD-1/PD-L1与Treg细胞的免疫调节作用及相关性研究进展作简要综述。; 王见之刘朝奇; 关键词：PD-1 PD-L1 TREG细胞免疫调节

小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究: 2009年; 目的：克隆小鼠PDL1膜外区（简称mPDL-1 IgV）基因，构建原核表达载体，检测其表达和生物学活性。方法：提取小鼠脾细胞总RNA，采用RT-PCR克隆mPDL-1 IgV基因，并将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建原核表达质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV，转化大肠杆菌DH5α，进行PCR和双酶切鉴定，并测序。筛选阳性菌落，提取质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析，同时纯化mPDL-1 IgV蛋白，进行生物学活性检测。结果：从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1 IgVcDNA克隆，重组质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV构建正确。转化pET28a（＋）／mPDL-1 IgV的E．coli BL21（DE3）成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白，并纯化mPDL-1 IgV蛋白，对其进行了复性和浓缩，复性后的蛋白显示出良好的生物学活性。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白，为进一步研究其功能提供了条件。; 覃晓琳刘朝奇李斌周永芹杨凡史继静吕佰瑞; 关键词：重组蛋白纯化生物学活性

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湖北省自然科学基金(2008CDB118)

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