国家科技支撑计划(2013BAD12B05)
- 作品数：25 被引量：55H指数：5
- 相关作者：李刚金红岩隋修锟步志高梁琳更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家自然科学基金国家公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及功能预测被引量：8
- 2016年
- 蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）编码4种非结构蛋白（NS1~NS4）,其中NS4是新发现的非结构蛋白。为深入探索该新型非结构蛋白的功能,本研究首先采用生物信息学分析其序列结构特征及可能的功能域,结果发现NS4蛋白的N端α-螺旋结构域中具有富含碱性氨基酸的核定位信号（NLS）,而C端α-螺旋结构域中具有亮氨酸拉链结构的核输出信号（NES）。为进一步证实NS4的亚细胞定位,本试验构建了表达NS4全长及其缺失突变体的重组质粒,结果显示缺失NLS的NS4重组蛋白弥散在胞浆,而缺失NES后NS4重组蛋白只定位于细胞核,表明NS4蛋白亚细胞定位具有核—胞浆穿梭过程。最后结合3D同源建模发现NS4与CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPβ）等具有较高的同源性,据此推测NS4可能为转录调控蛋白,与DNA或其他转录因子存在相互作用。总之,本研究为NS4蛋白的功能研究提供了更多新线索和新思路,填补了BTV基础研究的空白。
- 吕爽杨涛孙恩成徐青元张继凯吴东来
- 关键词：蓝舌病病毒亚细胞定位同源建模
- 蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定
- 2016年
- 蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP2、VP5、VP7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP7 3个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。
- 张继凯孙恩成杨涛徐青元吕爽王海秀张沁吴东来
- 关键词：蓝舌病病毒自激活作用
- 小反刍兽疫病毒H蛋白与SLAM受体相互作用的预测及初步鉴定
- 为了解小反刍兽疫病毒H蛋白与其SLAM受体相互作用的机制,进一步促进PPRV在感染、传播和致病机制的研究工作,本研究通过生物信息学技术对不同PPRV H蛋白和SLAM受体蛋白的胞外区、信号肽进行了预测.为进一步揭示PPR...
- 金红岩封家旺隋修馄李文超梁琳史利军赵占中薛晓娟赵玲娜Makay李刚
- 关键词：相互作用
- 裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析被引量：2
- 2015年
- 目的通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。
- 夏鹏魏建超陆莹梅武专昌李蓓蓓刘珂邵东华邱亚峰钟登科温贵兰马志永
- 关键词：原核表达蛋白纯化
- 埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建及鉴定被引量：4
- 2016年
- 埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)属于丝状病毒科,能够导致人和动物发生致命的埃博拉出血热和马尔堡出血热,这两种病是重要的尚未传入我国的烈性人兽共患病。为研制安全有效的储备疫苗,本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)反向遗传操作技术,将VSV自身糖蛋白(GP)分别替换为EBOV或MARV的GP,构建了表达扎伊尔型EBOV、苏丹型EBOV及MARV GP的嵌合VSV重组病毒r VSV△G/ZEBOVGP、r VSV△G/SEBOVGP及r VSV△G/MARVGP。Western blot和间接免疫荧光试验表明这3种GP蛋白在重组病毒感染的细胞中均能够正确表达。电镜观察结果显示,3种重组病毒均与亲本病毒具有相同形态特征,表明这3种外源GP蛋白均能够嵌合在重组病毒粒子表面。本研究构建的这3种重组病毒为进一步的动物免疫试验并评价其免疫效果奠定了基础。
- 邵钰王金良刘任强张会雷王喜军葛金英温志远步志高
- 关键词：埃博拉病毒马尔堡病毒囊膜糖蛋白水泡性口炎病毒
- 莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究被引量：2
- 2016年
- 莱斯顿型埃博拉病毒(REBOV)可以感染猪和非人类灵长类动物并引起动物发病和死亡,为制备安全、有效的REBOV重组病毒后备疫苗,本研究利用表达绿色荧光蛋白的水泡性口炎病毒(r VSV-EGFP)印第安纳弱毒疫苗株反向遗传操作系统,拯救出了REBOV GP蛋白嵌合型VSV(r VSV△G*GFP-REBOV-GP),并对其生物学特性进行分析,评估其作为REBOV活疫苗的安全性和有效性。激光共聚焦和western blot试验显示REBOV GP蛋白在嵌合病毒中获得正确表达;病毒生长动力学结果显示,r VSV△G*GFP-REBOV-GP与亲本株具有不同的生长特性;将r VSV△G*GFP-REBOV-GP接种小鼠,未引起小鼠发病,体重增长趋势与对照组一致,表明嵌合病毒具有良好的安全性;中和试验结果表明该嵌合病毒能够诱导小鼠产生针对REBOV GP的高滴度中和抗体。本研究制备的r VSV△G*GFP-REBOV-GP为进一步的动物免疫实验奠定了基础。
- 祖述龙宋继军邵钰刘任强温志远周微微王雪莲葛金英步志高
- 关键词：水泡性口炎病毒
- 表达西尼罗病毒囊膜糖蛋白PrM/E重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究
- 2015年
- 西尼罗病毒(WNV)是一种可以导致人与动物死亡的人兽共患病的虫媒病毒。为构建表达WNV Pr M/E蛋白的重组新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株并对其免疫原性进行评价,本研究利用反向遗传学操作技术将人工合成的WNV pr M/E基因插入至NDV基因组P和M基因之间,构建重组病毒r La-WNV-Pr M/E。以重组病毒分别感染BHK-21细胞和免疫小鼠,利用RT-PCR、间接免疫荧光、ELISA和流式细胞术(FACS)检测Pr M/E蛋白的表达情况及免疫效果。结果显示,WNV-Pr M/E蛋白在BHK-21细胞中获得正确表达,免疫小鼠可以诱导其产生高水平的抗Pr M/E蛋白特异性Ig G,并且诱导产生WNV E蛋白表位特异性CD4+和CD8+T细胞免疫反应。以上结果表明本研究构建的r La-WNV-Pr M/E可以作为一种具有前瞻性和储备性且安全有效的西尼罗热防控候选疫苗,对我国应对该病的潜在威胁具有十分重要的意义。
- 杨洁温志远葛金英王金良华荣虹邵钰步志高
- 关键词：西尼罗病毒重组新城疫病毒
- 实时荧光LAMP法检测转基因猪的标记基因hCD3被引量：2
- 2017年
- 利用ESE-Quant tube scanner监测平台,建立了一种基于实时荧光LAMP技术的hCD39基因快速检测方法。针对hCD39基因设计6条特异性引物,在63℃条件下,进行核酸扩增反应45 min。在扩增前加入SYBR GreenⅠ染料作为反应的指示剂,以SYBR GreenⅠ染料的荧光强度作为结果判定标准。该方法灵敏度高,最小可检测到3fg·μL-1;特异性好,与转基因猪中的标记基因hCD46、LEA29Y均无交叉反应;并且可对口腔拭子标本进行检测。因此,研究建立的实时荧光LAMP法,操作简单,反应快速,灵敏度高,特异性好,并且可以对猪活体进行无损伤采样检测,适合在现场快速简便的操作。
- 李津刘巍李俊超金红岩李刚
- 关键词：特异性检测
- 间接ELISA和竞争ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的比较被引量：5
- 2014年
- 旨在比较检测小反刍兽疫抗体的间接ELISA和竞争ELISA方法,通过诱导表达小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白,并以此作为包被抗原,检测94份绵羊和25份山羊血清样本。结果显示间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为74.8%,竞争ELISA与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.6%。竞争ELISA比间接ELISA方法检测结果可信度高,适于临床推广应用。
- 王净李刚史利军
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白间接ELISA竞争ELISA
- 小反刍兽疫病毒H基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫原性
- 2014年
- 旨在构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白的核酸疫苗,并评价其对小鼠的免疫原性。利用RT-PCR扩增了PPRV的H基因并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-H,然后转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,采用间接免疫荧光和Western blot检测H蛋白的瞬时表达情况。将重组质粒通过后腿肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA、淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测评价该DNA疫苗的免疫效果,结果表明,成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-H,并且能够在CEF细胞中表达。免疫小鼠后,pcDNA3.1-H能够诱导小鼠产生较高的特异性抗体水平,DNA疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)均高于空载体和PBS免疫组,并且能够分泌较高水平的IFN-γ和IL-4。因此,制备的DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较好的应用前景。
- 李文超隋修锟金红岩梁琳王文泉李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒DNA疫苗H基因免疫原性
