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HBc蛋白与NIRF蛋白细胞外相互作用鉴定被引量：2: 2012年; 构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3*FLAG-CMV-10中,构建出pGST-HBc及pFLAG-NIRF。pFLAG-NIRF转染HEK293,培养48 h,收获前10 h加入MG132抑制蛋白酶体,收获细胞,经NP40裂解后离心收集上清pGST-HBc转化BL21(DE3)细菌,优化培养条件使GST-HBc在上清中大量表达,然后用GST4Bgel亲合纯化该蛋白,结合有GST-HBc蛋白与含FLAG-NIRF的细胞上清孵育后,离心收集GST 4Bgel,经洗脱液洗脱后蛋白电泳,western blotting分析。构建了pGST-HBc及pFLAG-NIRF,在上清中成功表达GST-HBc并纯化该蛋白,在细胞中成功表达FLAG-NIRF,GST pull down结果显示两者存在体外相互结合。HBc与NIRF能够在细胞外发生相互结合。; 杨艳金方敏白露王筱绘段昌柱; 关键词：HBC 相互作用 GST PULL

乙型肝炎病毒C蛋白和X蛋白的修饰及其意义被引量：2: 2009年; 乙型肝炎病毒(HBV)作为一个外来入侵的病毒可以激发人体的免疫反应,导致人体一系列与HBV感染有关的病理变化与临床表现。HBC和HBX是由HBV基因编码的两种重要蛋白。HBC对病毒基因组的复制和成熟是必不可少的,其蛋白修饰后的产物对病毒在宿主细胞内的组装、成熟和对外分泌中发挥着作用。HBX能与多种蛋白发生相互作用,在HBV的复制中起着不可或缺的作用,也影响着肝细胞癌的形成。现有的对HBC和HBX的磷酸化和泛素化过程的研究,为进一步揭示HBV的致病机制提供了依据,希望最终为乙型肝炎的临床治疗寻找一条新的途径。; 钱冠华段昌柱; 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白磷酸化泛素化

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析被引量：3: 2009年; 目的克隆人NIRF基因,构建其真核表达质粒,并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术,从HeLa细胞中扩增NIRF基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U,并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA;重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后,可见约2400bp的目的片段;测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基,主要位于蛋白空间构象的表面;1Z6U片段含有Ring finger结构域,具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA,构建了其真核表达质粒,并利用生物信息学方法,初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。; 常蕾钱冠华段昌柱; 关键词：克隆真核表达质粒生物信息学

UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进H3K9乙酰化抑制细胞增殖被引量：1: 2016年; 目的探讨UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中对H3K9乙酰化及细胞增殖的影响。方法体外培养HEK293细胞,构建羟基脲所致的DNA损伤细胞模型;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒,用Western blot评估p CMV-3×Flag-UHRF2转染效率及H3K9乙酰化水平;CCK8法检测HEK293细胞增殖。结果 HEK293细胞经2.5 mmol/L羟基脲处理12 h后,DNA出现了明显的损伤;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒后,UHRF2蛋白表达显著升高(P<0.01);DNA损伤应答中H3K9乙酰化显著增加(P<0.05);细胞增殖能力明显下降(P<0.05)。结论 UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进组蛋白H3K9乙酰化抑制细胞增殖。; 赵灵林曾盛源王洋洋段昌柱; 关键词：羟基脲细胞增殖

过表达UHRF2通过上调p53及p21表达引起HEK293细胞G_1期阻滞被引量：1: 2014年; UHRF2(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 2)是新近发现的具有多个结构域的核蛋白,在细胞周期调控和表观遗传学中发挥重要作用.近期研究提示,UHRF2是肿瘤抑制蛋白p53的1个E3连接酶,在体内外能与p53相互结合并促进其泛素化,过表达UHRF2能使细胞周期停滞于G1期.然而,UHRF2介导的G1期阻滞及其与p53联系尚不清楚.通过共转染UHRF2质粒及p53特异性小干扰RNA(siRNAs)到HEK293细胞构建细胞模型,探索UHRF2引起细胞周期停滞与p53之间的关系.结果显示,UHRF2能促进HEK293细胞中p53的稳定,从而引起p21(CIP1/WAF1)基因表达,并使细胞周期停滞于G1期;但在siRNA抑制p53的表达后p21(CIP1/WAF1)表达降低,UHRF2引起的细胞周期阻滞消除.研究结果提示,UHRF2可通过稳定p53,上调p21的表达,从而介导细胞周期阻滞于G1期;同时UHRF2可能参与细胞周期调控及DNA损伤反应(DNA damage response,DDR).UHRF2稳定p53的具体分子机制及其在DDR中的作用有待进一步研究证明.; 宣艳艳张婷白露段昌柱; 关键词：细胞周期阻滞 P53 泛素化

蛋白酶体抑制剂MG132对肝癌细胞生长的影响及其机制被引量：1: 2012年; 目的探讨蛋白酶体抑制剂MG132对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15生长的影响及其机制。方法用不同浓度的MG132(0、250、500、1 000 nmol/L)处理HepG2和HepG2.2.15细胞,采用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测其对两种细胞增殖、细胞周期和细胞中相关蛋白GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin表达的影响。结果经MG132处理后,两种细胞的增殖均受到明显抑制,致使细胞周期阻滞在G1期,细胞中pGSK-3β和β-catenin蛋白的表达量上升,且均呈剂量依赖性,其对HepG2.2.15细胞的影响更为显著。结论 MG132可通过使肝癌细胞中GSK-3β失活和细胞周期阻滞抑制细胞增殖,为MG132成为一种新型HCC治疗药物提供了实验依据。; 钱冠华段昌柱彭惠民; 关键词：HEPG2细胞 HEPG2.2.15细胞原发性肝细胞癌

人NIRF蛋白与HBV核心蛋白相互作用的初步研究被引量：5: 2011年; 人NIRF蛋白在细胞内是否能与HBV核心蛋白发生相互结合,目前尚不清楚.构建pcDNA3-HBC质粒,采用基因共转染和共表达技术,在真核细胞内进行NIRF与HBc的免疫荧光共定位实验,并通过免疫共沉淀实验进一步验证两种蛋白是否发生相互结合.结果表明在细胞内,NIRF能与HBc发生相互结合.; 金芳敏钱冠华杨艳段昌柱; 关键词：HBC 免疫荧光免疫共沉淀

NIRF可抑制乙型肝炎病毒在水动力法转染HBV小鼠模型中的复制及表达: 2013年; 目前对NIRF(Np95/ICBP-90 like RING finger protein)的研究正朝着细胞癌变进程以及表观遗传学的方向发展,但在体内NIRF对乙型肝炎病毒(HBV)的复制及表达的影响,目前尚不明确.通过高压水动力法转染HBV小鼠模型,不同时间点收集血液和肝组织标本,荧光定量PCR检测血清及肝组织中病毒载量,WesternBlot检测肝组织HBc(hepatitis B virus core protein)表达,ELISA检测血清HBeAg表达,并通过免疫组化染色检测HBsAg、HBcAg在肝组织中的定位及表达.小鼠转染pAAV-HBV1.3和NIRF以后,血清及肝组织病毒载量降低(n=3,P<0.05),HBc蛋白及HBV相关抗原的表达受到抑制,说明在水动力法转染HBV小鼠模型中NIRF对HBV的复制及表达起到抑制作用,期待能为后续的HBV致病机理及治疗药物的研究与开发提供支持与帮助.; 胡斌周丹琳宣艳艳段昌柱; 关键词：乙型肝炎病毒动物模型

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其在HepG2.2.15细胞中的表达: 2009年; 目的构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白。方法从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达。结论已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。; 常蕾段昌柱; 关键词：真核表达质粒 HEPG2.2.15细胞

乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒的构建及其对人正常肝细胞株L0_2增殖的影响: 2012年; 目的构建乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒,并检测HBx对人正常肝细胞株L02细胞增殖的影响。方法以pcDNA3-HBV质粒为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pIRES2-EGFP荧光真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx,转染L02细胞,筛选稳定表达HBx的细胞,RT-PCR法检测细胞中HBx基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组荧光真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该质粒的L02细胞可检测到HBx基因mRNA的转录及蛋白的表达,与空质粒pIRES2-EGFP转染的L02细胞相比,增殖活力明显提高。结论成功构建了HBx基因荧光真核表达质粒,并获得了能稳定表达HBx蛋白的L02细胞株,为进一步研究HBx对细胞周期调控通路的影响及探索HBx导致的与HBV相关的HCC的分子机制奠定了基础。; 钱冠华董君军段昌柱彭惠民; 关键词：肝炎病毒乙型 X蛋白绿色荧光蛋白质类

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