国家自然科学基金(31072149)
- 作品数：6 被引量：20H指数：3
- 相关作者：崔治中苏帅孙鹏赵鹏陈俊霞更多>>
- 相关机构：山东农业大学中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国兽医药品监察所更多>>
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- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制被引量：1
- 2015年
- 以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中。用含有MDV-US2区50bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。
- 孙鹏李思菲张芙寿苏帅董宣赵鹏陈俊霞许书珍崔治中
- 关键词：马立克病病毒重组病毒
- 一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析被引量：6
- 2016年
- 山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。
- 李思菲孙鹏陈俊霞秦魁苏帅赵鹏崔治中
- 关键词：马立克氏病病毒MEQ基因
- 抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定被引量：3
- 2013年
- 【目的】制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV)sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定。【方法】以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化。用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体。用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体。【结论】制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定。
- 崔宁苏帅李久庆赵鹏李延鹏丁家波崔治中
- 关键词：多克隆抗体WESTERNBLOT间接免疫荧光
- 中国3种不同地方品系鸡对马立克病毒超强毒株rMd5易感性比较被引量：2
- 2014年
- 比较了马立克病毒超强毒株rMd5对中国3种不同地方品系鸡(济宁百日鸡、汶上芦花鸡、寿光黑鸡)的致病性。将rMd5分别腹腔接种1日龄(500 PFU·只^-1)和7日龄(1500 PFU·只^-1)不同品系鸡并饲养90 d。结果表明rMd5均能够引起3种地方品系鸡的特异性马立克病变,但是致病性的强度差异显著:寿光黑鸡的死亡率和肿瘤发生率明显高于其他2种鸡,几乎和SPF鸡类似,而且rMd5在寿光黑鸡群中的横向传播能力最强;济宁百日鸡和汶上芦花鸡相比对rMd5的抗感染和抗病能力强。因此,济宁百日鸡和汶上芦花鸡可作为遗传抗性基因的筛选和遗传抗性机制研究的候选品系。
- 崔宁苏帅陈孜孟赵孝民崔治中
- 关键词：马立克病遗传抗性
- 马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定被引量：3
- 2015年
- 本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒（MDV）感染性克隆基因组中细菌人工染色体（BAC）序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9—1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞（CEF）拯救SC9—1重组病毒。将SC9—1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养，利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1～10代不同代次SC9—1重组病毒的DNA作为模板，利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物，以MDV保守基因pp38作为内参，对不同代次病毒基因组中BAc序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9—1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列，通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示，1～5代病毒DNA均能扩增出600bp的特异性目的条带，证实病毒的基因组中含有BAC序列。6～10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带，证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示，病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少，直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中，对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定，结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点，序列同源性均在99．7％以上。结果表明，利用cre／loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDVmeq基因缺失株SC9—1的BAC序列完全敲除掉，且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。
- 孙鹏苏帅李延鹏丁家波崔治中
- 关键词：马立克氏病MEQ基因细菌人工染色体
- 3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析被引量：7
- 2017年
- 为了解国内鸡群马立克病(MD)毒株目前的流行情况,在我国3个已免疫MD疫苗的白羽肉种鸡场暴发MD的鸡群中,通过临床剖检,组织病理学变化,病毒分离,IFA检测从发病鸡的淋巴细胞中分离到3株马立克氏病毒(MDV),并分别命名为SDAU1501、SDAU1502和SDAU1503。采用PCR方法扩增3株MDV的vIL8、pp38、meq致病基因,所得氨基酸序列与已发表的参考毒株序列进行比较分析,结果显示SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株的同源性达到97%以上,具有强毒特征;而SDAU1503的meq基因在第194位具有与CVI988同样的缺失(P),但其没有CVI988中177个核苷酸的插入突变,其具有与弱毒疫苗株的特征。MDV新的变异在不断发生,出现了不同类型的变异株,因此,对MD的流行情况与基因监测应当继续下去;同时,在MDV疫苗的研制更新上还有待于进一步研究。
- 刘英楠孟凡峰李阳孙鹏栾怀彪苏红芹崔贺常爽赵鹏崔治中
- 关键词：马立克病病毒病毒分离鉴定
