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微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备: 2012年; 以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。; 秦培兰米荣升黄燕周鹏张国恩苏庆美呼高伟曹薇陈兆国; 关键词：微小隐孢子虫原核表达重叠延伸PCR

3种保虫宿主日本血吸虫特征性差异表达基因的筛选与验证: 2012年; 目的筛选日本血吸虫3种重要保虫宿主来源虫体的特征性差异表达基因,寻找可以用于鉴别这3种宿主来源虫体的遗传标记。方法日本血吸虫尾蚴人工感染黄牛、水牛和山羊,收集感染后49 d成虫,分别抽提RNA,逆转录成cD NA,体外转录为cRNA并进行片段化;采用定制的血吸虫芯片分别进行杂交,筛选每种宿主来源虫体的特征性差异表达基因。采用实时定量PCR法对所筛选差异表达基因的表达水平做进一步测定,验证芯片数据的结果,并对这些特征性差异表达基因进行验证。结果通过芯片杂交,分析筛选获得实验黄牛组来源虫体特征性差异表达基因3个,水牛组来源虫体4个,山羊组来源虫体7个。其中黄牛组2个、水牛组3个、山羊组5个特征性差异表达基因在另一批次3种宿主来源虫体的重复试验中得到验证。结论芯片杂交筛选出10个3种宿主来源虫体的特征性差异表达基因,这些基因可能可以作为这3种不同宿主来源虫体的遗传标记。; 杨健美石耀军冯新港傅志强苑纯秀刘金明洪炀李浩陆珂林矫矫; 关键词：日本血吸虫保虫宿主芯片

微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及其抗血清的制备: 以微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR（SOE PCR）将该三段基因片段串联在一起,各基因片...; 秦培兰米荣升黄燕周鹏张国恩苏庆美呼高伟曹薇陈兆国; 关键词：微小隐孢子虫原核表达重叠延伸PCR; 文献传递

MicroRNA及其研究现状被引量：1: 2012年; MicroRNA（miRNA）是一类非编码的内源性小RNA分子，长度约20-25个核苷酸（nucleo-tides，nt），参与调控诸多基因的表达。miRNA的作用方式有2种：一种是通过与靶标基因mRNA的完全匹配结合，促使mRNA发生降解；另一种是通过不完全地与靶mRNA的3’非编码区（3’untrans-; 呼高伟陈兆国程天印许娟; 关键词：MICRORNA 基因MRNA 非编码区 RNA分子内源性多基因

微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析被引量：4: 2012年; 应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm。将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列。Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础。; 秦培兰李艳米荣升呼高伟黄燕周鹏张国恩苏庆美曹薇陈兆国; 关键词：微小隐孢子虫抗原表位重叠延伸PCR 抗原性

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察: 2012年; 利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。; 张国恩米荣升周鹏黄燕秦培兰呼高伟曹薇陈兆国; 关键词：微小隐孢子虫体外感染 HCT-8细胞

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定被引量：1: 2012年; [目的]构建微小隐孢子虫的miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAXⅠ载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能奠定了基础。; 呼高伟程天印米荣升秦培兰黄燕周鹏曹薇陈兆国; 关键词：前体真核表达载体 RT-PCR

微小隐孢子虫P23基因在毕赤酵母中的表达及初步应用: 2012年; 为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。; 黄燕米荣升周鹏曹薇杨晓娇王向佩王晓娟石凯陈兆国; 关键词：微小隐孢子虫巴斯德毕赤酵母真核表达

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国家科技重大专项(2012ZX10004220-008)