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空肠弯曲菌mcp1／2／3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性被引量：4: 2009年; 目的克隆空肠弯曲菌（Campy1obacter jejuni）接受甲基趋化蛋白（MCP）编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统，建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质，了解MCPs与趋化诱导物之间的关系。方法PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段，T-A克隆后测序。构建上述目的基因原核表达系统，SDS—PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况，Ni—NTA亲和层析法提纯rMCPs。rMCPs免疫家兔获得抗血清，免疫扩散法测其效价。用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG，经胃蛋白酶酶解和Sephadex G-100层析制备IgG F（ab′）2。建立HAP（hard—agar plus）法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用。采用基于IgG F（ab′）2封闭的趋化阻断试验，确定不同MCPs的功能及其差异。结果PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mcp3基因片段，其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs，其产量均约为细菌总蛋白的10％。rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体，其免疫扩散效价均为1：4。牛胆汁和脱氧胆酸钠（DOC）对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用（P〈0．05）。MCP1和MCP2被其IgG F（ab′）2封闭后，空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱（P〈0．05），MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响（P〉0．05）。结论本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白。牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质，MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程。; 李志锋赵金方楼宏强毛亚飞李立伟林旭瑷严杰; 关键词：空肠弯曲菌趋化

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响被引量：2: 2009年; 目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐药性关系。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段，T—A克隆后测序。构建phoQ和phoP基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rPhoQ和rPhoP，皮内注射免疫法制备兔抗血清，免疫双扩散法测定抗血清效价。采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因，采用PCR、测序和Westernblot对phoQ。突变株进行鉴定。采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗，丰素的最低抑菌浓度（MIC）。结果与GenBank中相关序列比较，所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98．7％一99．6％和98．7～100％、98．4％～99．8％和99．1％～100％。采用pET-42a和E．coliB121DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP。rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1：4和1：8抗血清。经PCR、测序和Westernblot鉴定，两株phoQ^-突变株phoQ基因及产物均缺失。上述phoQ^-突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1／512～1／2048。结论PhoQ／PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统，该系统介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。; 汪浙炯夏肖萍楼宏强孙爱华严杰; 关键词：铜绿假单胞菌基因敲除氨基糖苷类抗生素

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国家重点实验室开放基金(2008ZZ06)

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