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Dravet综合征患者SCN1A基因启动子区突变位点的检测及分析被引量：2: 2009年; 目的对Dravet综合征患者SCN1A基因启动子区突变位点进行筛查及分析,预测其致病易感性。方法收集24例Dravet综合征患者及100例正常人的外周血,抽提基因组DNA,PCR扩增SCN1A基因启动子区序列并测序;用生物信息学方法分析了SCN1A启动子区变异位点邻近序列的保守性及潜在的结合元件,推测其致病易感性。结果从患者中发现两个突变位点-244 C>T和-662 G>-,都来自父亲,而没有血亲关系的正常人中没有发现;-244和-662突变位点在哺乳动物中高度保守(100%);人与其他哺乳动物之间-244突变位点邻近序列(位点上、下游20个碱基)的平均同源率高达90%,而-662突变位点邻近序列的平均同源率只有60%;含-244位点的序列分别能预测到4种不同的转录因子结合元件,而含-662位点的序列均未能预测到。结论这两个突变与疾病存在一定程度的相关性,其致病的机制有待于实验证实。; 龙跃生林绍鹏石奕武廖卫平; 关键词：SCN1A 启动子突变保守性

同卵双生的界限型婴儿重症肌阵挛癫痫患者中的钠通道α1基因新突变被引量：2: 2009年; 目的筛查一对同卵双胞胎界限型婴儿重症肌阵挛癫痫（borderland severe myoclonic epilepsy of infancy，SMEB）患儿的钠通道α1（sodium channel α1-subunit，SCN1A）基因并探讨其临床特性。方法总结这对同卵双生子患者的临床特点，应用变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技术筛查SCN1A基因全部26个外显子，对发现有异常洗脱峰者再进行直接测序。结果这对孪生姐妹患者均具有典型SMEB的临床特点，她们在SCN1A基因第26号外显子被发现有相同的杂合突变（c．5348C〉T），并导致编码的氨基酸改变（A1783E），为国际上首次发现该位点突变。结论临床表型相似的SMEB同卵双胞胎存在相同位点的SCN1A基因突变，证实SMEB与婴儿重症肌阵挛癫痫同样是基因异常引起的疾病，而且基因与临床表型密切相关。; 陈俐石奕武于美娟邓维意刘晓蓉高玫梅常好会龙跃生易咏虹廖卫平; 关键词：肌阵挛性神经组织蛋白质类钠通道高压液相突变

癫痫相关基因SCN1A启动子区多态性位点的生物信息学分析被引量：1: 2009年; SCN1A是多种神经系统疾病的致病基因，该基因的精确表达对于维持神经系统正常功能非常重要．为了认识SCN1A启动子区多态性位点（single nucleotide polymorphisms．SNPs）的保守性及其功能意义，应用生物信息学方法分析了目前已发表位于SCN1A启动子区的11个SNPs，分别命名S1～S11．分析结果表明，S3、S5和S7等位基因频率没有人种差异性．其余SNP等位基因频率均有人种差异性；接近核心启动子的SNPs要比远离核心启动子SNPs的保守程度高．提示靠近核心启动子的SNPs影响SCN1A基因表达的概率可能越大；大部分SNPs祖传等位基因在哺乳动物中是保守的（S3除外）。暗示这些SNPs新生等位基因有可能在人类进化过程起到一定的作用：启动子分析软件预测发现。含S2、S4、S8及S9等4个SNPs不同等位基因的同一序列分别存在不同转录因子结合元件．而含S1和S11不同等位基因的同一序列都只能预测到含其中一个等位基因的序列存在转录因子结合元件．这些差异可能是SNPs影响SCN1A表达的重要原因之一．这些分析将为进一步研究．SCN1A启动子区SNPs与神经系统疾病的相互关系打下基础．; 龙跃生石奕武林绍鹏曾涛赵绮华廖卫平; 关键词：单核苷酸多态性启动子

结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变被引量：1: 2008年; 目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCN1A进行定点突变。方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2)。通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆。结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体。结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变。; 龙跃生蔡阳林赵绮华廖卫平; 关键词：融合PCR 定点诱变 SCN1A 癫痫

钠通道SCN1A基因短发夹RNA表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的沉默效果: 2009年; 目的采用人SCN1A基因非保守区DNA构建短发夹RNA(shRNA)稳定表达的重组质粒,在HEK293细胞中抑制SCN1A基因表达。方法PCR分别正反向扩增SCN1A基因特异序列,构建成一个绿色光蛋白(GFP)与发夹结构RNA(shRNA)融合表达的重组质粒pEGFP-SCN1A-shRNA;该质粒和对照质粒(pCMV-EGFP)分别与SCN1A基因表达质粒(pCMV-SCN1A)共转染HEK293细胞株,采用半定量RT-PCR及双荧光共定位法鉴定SCN1A基因的表达情况。结果与对照相比较,shRNA表达质粒转染的培养细胞中SCN1A基因mR-NA表达量下调90%;双荧光共定位显示实验组阳性细胞中只检测到GFP蛋白,未能检测到Nav1.1,而对照组阳性细胞中能同时检测到GFP蛋白和Nav1.1。结论shRNA表达质粒在培养细胞中能有效地抑制SCN1A基因的表达。该质粒可进一步改造成腺病毒表达载体,在动物脑组织中进行永久性表达,建立癫痫等神经系统疾病的动物模型,可望成为致病机理研究和开发新治疗途径的工具。; 龙跃生孙卫文赵绮华曾涛廖卫平; 关键词：RNA干扰钠通道

GEFS^+致病相关基因SCN1A表达载体的定点诱变被引量：5: 2007年; 目的:利用长距离PCR定点突变技术对GEFS+致病相关基因SCN1A进行定点诱变。方法:在突变位点处设计一对延伸方向相反的引物,通过长距离PCR扩增,得到携带突变位点的新质粒;然后用Dpn I酶切去掉母质粒;再转化至大肠杆菌进行克隆。结果:DNA测序表明:在预期位点已经发生突变,SCN1A所编码的第1765位密码子由苯丙氨酸(Phe)突变为亮氨酸(Leu)。结论:SCN1A突变表达载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致I型电压依赖型钠通道功能的改变奠定了基础。; 蔡阳林龙跃生石奕武邓维意高枚眉赵绮华孙卫文廖卫平; 关键词：聚合酶链反应 SCN1A 癫痫

人及小鼠钠通道SCN3A基因的启动子及其上游调控区的分析被引量：1: 2009年; 为了比较研究人与小鼠SCN3A基因的启动子及其上游调控区的特征,采用5′-FullRACE方法对人及小鼠SCN3A基因的转录起始点进行了准确定位,通过序列测定及对比分析证明:确定人和小鼠SCN3A基因的转录起始点均为"A",人SCN3A基因转录起始点位于翻译起始点上游约27kb处,而小鼠位于翻译起始点上游约31kb处.人SCN3A基因5′非翻译区存在两个5′非翻译外显子,而小鼠只有一个5′非翻译外显子.人和小鼠SCN3A基因核心启动子区(-80～+70)的同源率高达96.0%,存在相同的启动子核心元件,BRE/和TATA;在-400至+200区段内预测到人存在而小鼠不存在的转录因子有PHR1、GATA-1、FOXN2、NF-1及AP-4,小鼠存在而人不存在的转录因子Sp、Sp3及GBF.人和小鼠SCN3A启动子区特征的异同将为进一步研究该基因在人和小鼠的表达调控机制提供重要线索.; 龙跃生赵绮华曾涛曾杨孙卫文廖卫平; 关键词：启动子

豚鼠脑中表达的磷酸二酯酶基因cDNA序列的鉴定与分析(英文): 2010年; 目的环核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)是一氧化氮(nitric oxide,NO)信号转导途径中的一个关键成员,在认知与学习、帕金森病、注意缺陷多动障碍、精神病和抑郁症等过程中发挥重要作用。PDE在豚鼠脑中的表达情况还未见报道。本研究旨在对豚鼠脑中表达的Pde cDNA序列进行鉴定与分析。方法根据人PDE和小鼠Pde cDNA序列的22个保守区设计引物,采用RT-PCR法扩增豚鼠脑中表达的未知Pde基因cDNA部分序列,并采用生物信息学软件分析不同物种间Pde cDNA序列及氨基酸多肽序列的同源性及保守功能基序。结果在豚鼠脑中发现了11个新的Pde基因cDNAs,包括CpPde1a、CpPde1b、CpPde2a、CpPde4a、CpPde4d、CpPde5a、CpPde6c、CpPde7b、CpPde8a、CpPde9a和CpPde10a。豚鼠与人之间的Pde基因cDNA序列的同源率在83.8%-94.3%之间,氨基酸序列的同源率在91.9%-100%之间。豚鼠与小鼠之间的Pde基因cDNA序列的同源率在84.6%-92.1%之间,氨基酸序列的同源率在91.2%-99.2%之间。此外,这11个Pde cDNAs在豚鼠与人之间的平均同源率显著高于在豚鼠与小鼠之间的同源率(P<0.01)。豚鼠的部分氨基酸序列具有至少一个人及小鼠PDE蛋白的保守功能区。结论这些发现为进一步研究PDE在大脑中的生理功能打下了基础。; 龙跃生黄敏齐廖卫平; 关键词：中枢神经系统一氧化氮

部分性癫痫伴热性惊厥附加症家系中的SCN1A基因嵌合突变被引量：4: 2008年; 目的筛查一个部分性癫痫伴热性惊厥附加症（partial epilepsy with febrile seizures plus，PEFS^＋）家系中的钠通道α1基因（voltage-gated sodium channel αl-subunit，SCN1A）及其遗传特性。方法总结一个PEFS^＋家系中2例患者及其父亲的临床特点，应用变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技术筛查SCN1A全部26个外显子，发现有异常洗脱峰者进行直接测序，对直接测序未能证实突变的再进行焦磷酸测序。结果先证者及其同父异母姐姐均为PEFS^＋患者，他们在SCN1A基因第26号外显子发现有相同的杂合突变A5768G，并导致编码的氨基酸改变Q1923R，其父亲儿时频繁出现热性惊厥（febrile seizures，FS），后自然痊愈，直接测序未发现异常，进一步用焦磷酸测序则发现该位点存在嵌合突变（突变量为25％）。结论SCN1A基因突变可导致部分性癫痫。PEFS^＋可遗传，而携带致病基因者可因体内发生嵌合突变，致病基因含量偏低导致临床症状轻微。; 陈俐石奕武邓维意于美娟龙跃生刘晓蓉高玫梅常好会易咏虹廖卫平; 关键词：钠通道神经组织蛋白质类突变

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广东省自然科学基金(06301101)

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