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一种酸性真菌α-淀粉酶的异源表达与重组酶性质被引量：5: 2013年; 用PCR方法扩增扣囊复膜孢酵母CICIM Y1037菌株真菌α-淀粉酶基因成熟肽编码区(SfA),插入表达载体pPIC9K。重组质粒pPIC9K-SfA转化巴斯德毕赤酵母GS115,筛选获得淀粉酶活力相对最高的重组菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-SfAmy LZ08。SDS-PAGE电泳分析纯化获得的重组酶SfA,结果显示重组酶分子质量为61 kDa左右。SfA最适反应温度为45℃、最适pH为4.5,是一种酸性α-淀粉酶。Ca2+对SfA的热稳定性有促进作用,重组酶在含5 mmol/L Ca2+,pH 4.5的溶液中,55℃保温4 h酶活仍保留80%以上。SfA水解玉米淀粉获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖和麦芽三糖为主要产物,分别占水解物的37%和39%。重组酶SfA在麦芽三糖和麦芽寡糖糖浆生产中有一定的应用潜力。; 沈微林丽珍黄雯雯郭玉婉陈献忠樊游王正祥; 关键词：巴斯德毕赤酵母异源表达

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质被引量：7: 2017年; 用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg^(2+)对重组酶有激活作用,而Ca^(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。; 肖亚朋沈微李婷霖陈献忠樊游; 关键词：异源表达蛋白纯化酶学性质

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达被引量：4: 2015年; 提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。; 范如意牛丹丹应喜娟沈微陈献忠; 关键词：解淀粉芽孢杆菌地衣芽孢杆菌异源表达

Reconstruction of tyrosol synthetic pathways in Escherichia coli被引量：3: 2018年; Tyrosol is a pharmacologically active phenolic compound widely used in the medicine and chemical industries.Traditional methods of plant extraction are complicated and chemical synthesis of tyrosol is not commercially viable. In this study, a recombinant Escherichia coli strain was constructed by overexpressing the phenylpyruvate decarboxylase ARO10 from Saccharomyces cerevisiae, which could produce tyrosol from glucose. Furthermore,genes encoding key enzymes from the competing phenylalanine and tyrosine synthesis pathways and the repression protein TyrR were eliminated, and the resulting engineered strain generated 3.57 mmol·L^(-1) tyrosol from glucose. More significantly, codon optimization of ARO10 increased expression and tyrosol titer. Using the novel engineered strain expressing codon-optimized AR10 in shake-flask culture, 8.72 mmol·L^(-1) tyrosol was obtained after 48 h. Optimization of the induction conditions improved tyrosol production to 9.53 mmol·L^(-1)(1316.3 mg·L^(-1)). A higher titer of tyrosol was achieved by reconstruction of tyrosol synthetic pathway in E. coli.; Cui YangXianzhong ChenJunzhuang ChangLihua ZhangWei XuWei ShenYou Fan; 关键词：TYROSOL ESCHERICHIA COLI DECARBOXYLASE KNOCKOUT CODON

热带假丝酵母脂肪醛脱氢酶基因CtAld1和CtAld2的功能评价被引量：1: 2018年; 【目的】热带假丝酵母是发酵法生产二元酸的重要工业菌株,具有较高的ω-氧化活性。脂肪醛脱氢酶在ω-氧化途径中起重要作用,催化脂肪醛生成脂肪酸,但其具体催化功能及对细胞生理影响还未被系统研究。本文通过删除脂肪醛脱氢酶基因CtAld1和CtAld2鉴定了其在ω-氧化途径中的功能。【方法】通过基因组信息挖掘获得热带假丝酵母脂肪醛脱氢酶基因CtAld1和CtAld2序列,在此基础上,通过同源重组敲除CtAld1和CtAld2基因。考察突变株的生长和胞内脂肪醛脱氢酶活性变化,并评价CtAld1和CtAld2基因敲除对细胞二元酸合成能力的影响。【结果】分别获得了热带假丝酵母突变株XZX-1(ΔCtAld1/ΔCtAld1)、XZX-2(ΔCtAld2/ΔCtAld2)和XZX-12(ΔCtAld1/ΔCtAld1,ΔCtAld2/ΔCtAld2)。在以十二烷为唯一碳源的培养基中,敲除CtAld2基因显著抑制细胞的生长,胞内脂肪醛脱氢酶活性降低为出发菌株的30%;敲除CtAld1基因尽管会使细胞损失一部分醛脱氢酶活性,但能够一定程度地提升细胞在十二烷中的生长性能。敲除CtAld1或CtAld2会降低菌株二元酸产量,组合敲除CtAld1和CtAld2严重削弱菌株十二碳二元酸的合成能力。【结论】CtAld2对热带假丝酵母细胞的生长和十二碳二元酸的合成具有重要作用,缺失CtAld1或CtAld2基因降低细胞的二元酸合成能力。CtAld1和CtAld2可作为热带假丝酵母ω-氧化途径代谢工程改造的潜在靶点。; 王泽政张利华张满琪胡世元李莉沈微樊游陈献忠; 关键词：热带假丝酵母十二碳二元酸

黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达及重组酶性质被引量：2: 2021年; 以黑曲霉(Aspergillus niger)高耐热葡聚糖酶编码基因eglA6在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中的表达及重组酶性质为研究目的。利用乳酸克鲁维酵母表达系统,构建表达eglA6基因的重组菌K.Lactis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105,重组菌摇瓶发酵酶活达到23.0 U/mL。重组酶AnEglA6K表观相对分子质量为5.6×10^(4),明显高于同一基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物。重组酶最适pH为5.0,最适温度为75℃,在80℃时酶活半衰期为65.0 min。以微晶纤维素为底物时重组酶比酶活约为0.5 U/mg。基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达产物与其在巴斯德毕赤酵母中的表达产物有明显差异,前者相对分子质量明显高于后者,热稳定性和结晶纤维素降解活性也高于后者。以乳酸克鲁维酵母为宿主表达eglA6基因获得的重组葡聚糖酶具有很高的耐热性,适合在饲料工业中应用。; 王施岚徐楚涵姚雁杨梦莲德青美朵沈微杨海泉杨海泉陈献忠; 关键词：黑曲霉乳酸克鲁维酵母糖基化

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用被引量：1: 2022年; 作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45℃。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。; 祝冬君张锦雯姚雁单逸蓝杨梦莲沈微杨海泉杨海泉陈磊陈献忠; 关键词：枯草芽孢杆菌普鲁兰酶分泌表达

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用被引量：1: 2019年; 为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因GsP在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达GsP的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为GsP1a和GsPwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以GsP1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由GsPwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。; 王婕朱新文德青美朵姚雁沈微陈献忠陈献忠; 关键词：普鲁兰酶马铃薯粉丝

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达被引量：11: 2016年; 根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。; 王兵波沈微钱灵紫李琛罗枭樊游陈献忠; 关键词：密码子优化巴斯德毕赤酵母高密度发酵

一小型温泉中降解淀粉细菌的筛选、鉴定与淀粉酶性质初步分析被引量：1: 2014年; 为筛选耐热淀粉酶产生菌并揭示其在温泉中的分布情况,从腾冲县腊幸村一小型热泉不同部位采集样品进行微生物分离及鉴定。样品在65℃培养,挑选形态有差异的菌落点种淀粉-台盼蓝平板,共获得34株具有淀粉降解能力的细菌。分子鉴定结果显示,从温泉底部沙土中筛选得到细菌具有较高的生物多样性,9株具有淀粉降解能力的细菌分别属于土芽胞杆菌(Geobacillus)、厌氧芽胞杆菌(Anoxybacillus)和芽胞杆菌(Bacillus)3个属、7个种,菌株间16S rDNA序列均有一定的差异。对编号为201(Geobacillus thermoglucosidasius)和208(Anoxybacillus flavithermus)的菌株胞外淀粉酶进行初步分析,其胞外淀粉酶最适温度分别为60和70℃,均高于淀粉糊化温度,具有一定的应用潜力。; 莫芹李腾云沈微樊游陈献忠王正祥石贵阳; 关键词：温泉淀粉酶嗜热细菌

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国家高技术研究发展计划(2013AA102101-5)

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