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小鼠角蛋白10(K10)基因启动子的克隆及活性分析: 2016年; 【目的】角蛋白10(K10)是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一,在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时,可以作为特异的启动子。本研究欲筛选K10较强的启动子片段,为研究K10以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组DNA,经质量鉴定后,采用PCR法扩增K10的6个不同片段(F1—F6),并将其分别亚克隆到p MD18-T载体,经测序验证是否正确;将K10的6个亚克隆片段再克隆到p GL0载体中,产生p GL0-F1—F6构建,用脂质体法转染293T细胞,转染结束后将细胞裂解,并通过双荧光素酶报告基因检测6个片段转染细胞后引起的荧光素酶活性变化,以筛选启动效果最好的启动子片段;用筛选到的K10启动子片段作为特异启动子,替换p GL0载体上的CMV强启动子,并与周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)基因进行重组,形成p GL0-F-CDK5构建,用脂质体法转染小鼠皮肤角化细胞,待转染结束后,分别进行细胞爬片、细胞裂解和细胞总RNA的提取,之后用免疫荧光化学、双荧光素酶报告基因检测法和实时荧光定量PCR法检测CDK5的表达定位、表达水平及荧光素酶活性,以检测其在角化细胞中的启动效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最强的K10启动子片段,发现其可能的转录因子结合位点。【结果】PCR扩增、克隆得到K10启动子的6个片段(F1—F6),片段大小分别为1 201、908、664、787、790、656 bp;质粒p GL0-F1—F6分别转染293T细胞后,通过双荧光报告检测发现长度为787bp的F4启动子活性最强;但F1—F6启动子的活性均弱于p GL0-basic中CMV的启动活性;F4序列中含有基本启动子保守区域的共同序列即TATAAAA,经Promoter Scan分析发现F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多个转录因子的结合位点,这些位点利于K10在角化细胞中表达;p GL0-F4-CDK5转染角化细胞后,通过荧光蛋�; 张俊珍刘彧姬凯元杨姗姗胡帅鹏刘学贤范瑞文; 关键词：角蛋白10 启动子特异启动子 CDK5 小鼠

lpa-miR-nov-66调控羊驼黑色素细胞CDK5磷酸化作用的研究: 2016年; 旨在研究lpa-miR-nov-66在调控羊驼黑色素细胞产生黑色素颗粒过程中对细胞周期依赖性激酶5(CDK5)磷酸化作用的影响。在体外培养的黑色素细胞中转染lpa-miR-nov-66后,采用实时定量PCR、免疫细胞化学、Western blotting、免疫共沉淀等方法检测功能性CDK5作用。结果显示:与阴性对照相比,黑色素细胞被转染lpa-miR-nov-66后,CDK5基因和蛋白表达量均下降,差异极显著(P<0.01);CDK5激活子是P35,CDK5磷酸化水平及其磷酸化底物——酪氨酸羟化酶(TH)的表达量均被上调,分别呈差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。结果表明:lpa-miR-nov-66过量表达可通过CDK5的激活子P35上调黑色素细胞CDK5发生磷酸化。该功能性CDK5激酶对底物TH发生磷酸化,是lpa-miR-nov-66调控黑色素生成分子机制的中间环节。; 张俊珍姬凯元石占全刘彧胡帅鹏范瑞文; 关键词：黑色素细胞

绵羊皮肤鸟苷酸环化酶完整CDS区结构域分析: 2015年; 用RT-PCR法获得了绵羊皮肤的鸟苷酸环化酶完整CDS区,其长度为1 860 bp,与其他哺乳动物相比,高度保守。通过对其结构域分析,发现绵羊鸟氨酸环化酶(GC)编码区存在环化酶同源性结构域(CHD)、血红素一氧化氮结合位点(HNOB)和相关血红素一氧化氮结合位点(HNOBA),这些结构域分别发挥其催化功能以及在细胞内转导下游信号的功能。; 杨姗姗姬凯元石占全焦丁兴白俊明范瑞文董常生; 关键词：鸟苷酸环化酶皮肤结构域绵羊

羊驼皮肤基因转录因子及其结合位点分析被引量：1: 2013年; 哺乳动物皮肤具有多种功能,这些功能是由基因决定的,而基因的表达要受到转录因子的调节。本研究通过参照人皮肤基因的转录因子分析羊驼皮肤的EST库,发现了8个转录因子和6个转录因子结合位点,它们调控着羊驼生活适应性、皮肤生理特征以及皮肤衍生物的生理特性等,其中重要的有调控羊驼黑色素细胞内决定其毛色的转录因子microphthal-mia-associated transcription factor(MITF)及其结合位点cyclic adenosine monophosphate response element-binding 1(CREB-1),用实时荧光定量PCR法检测发现二者在不同羊驼毛色皮肤中的表达在转录水平存在显著差异,它们的生物学特点对研究羊驼皮肤中决定羊驼皮肤生理功能和羊驼毛色的分子机理提供了重要的理论基础。; 张俊珍范瑞文白俊明董常生; 关键词：羊驼皮肤毛色转录因子转录因子结合位点

TGF-β3对体外培养的羊驼黑色素细胞的影响被引量：3: 2015年; 为了研究转化生长因子β3(Transforming growth factor beta3,TGF-β3)对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞表型的影响。本研究在体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度TGF-β3(6.25、12.5、25、50ng·mL-1),通过实时监测和检测细胞增殖、毛色相关基因小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia—associtated transcription factor,MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)和酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase related protein 2,TYRP2)表达以及黑色素产量的变化。结果表明:(1)在羊驼皮肤黑色素细胞中添加50ng·mL-1浓度的TGF-β3后,在前30h内对细胞增殖有抑制效果,30h后对细胞增殖有明显的长时程维持细胞数量作用,但对TGF-β3添加的剂量没有依赖性;(2)添加TGF-β3后,黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达量均被下调,而且黑色素细胞产生黑色素的量也被下调,主要以添加50ng·mL-1时下调最为显著。结果揭示,TGF-β3通过对羊驼黑色素细胞内MITF、TYR和TYRP2的表达的影响,并调控黑色素的产生,对黑色素细胞的生物学功能具有重要的影响。; 刘彧石占全姬凯元杨姗姗范瑞文; 关键词：转化生长因子Β3 黑色素黑色素细胞羊驼

lpa-miR-nov-66通过调控cAMP路径抑制α-MSH介导的羊驼黑色素生成被引量：4: 2015年; α-黑素细胞刺激素(α-MSH)和lpa-miR-nov-66在羊驼黑色素细胞产生黑色素过程中均起重要的调控作用,但二者之间的关系尚未报道.本研究在体外培养的羊驼黑色素细胞中通过转染lpamiR-nov-66和添加α-MSH处理,用实时定量PCR和Western印迹检测黑色素细胞内基因表达水平,ELISA法检测c AMP和cGMP的产量,RTCA实时无标记细胞功能分析黑色素细胞增殖以及紫外分光光度法检测黑色素产量,证实二者在调控羊驼黑色素细胞产生黑色素颗粒过程中的关系.结果显示,与单纯α-MSH处理相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,小眼转录因子(MITF)和酪氨酸酶(TYR)在转录水平和翻译水平的表达均降低,而酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)在转录和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量升高,cAMP的产量下降;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量下降.与单纯转染lpa-miR-nov-66相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,MITF、TYR和TYRP2在转录水平和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量下降,cAMP的产量升高;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量升高.上述结果证明,lpa-miR-nov-66通过调控羊驼黑色素细胞中毛色形成的c AMP路径,抑制α-MSH对黑色素细胞产生黑色素的促进作用.; 姬凯元石占全刘彧杨姗姗胡帅鹏张俊珍范瑞文; 关键词：黑色素细胞

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山西省科技攻关计划项目(20120311024-2)

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