国家自然科学基金(81070077)
- 作品数：8 被引量：53H指数：3
- 相关作者：许秀芳李温斌辛毅黄益民张颖更多>>
- 相关机构：首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所焦作矿务局更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金北京市优秀人才培养资助更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定被引量：27
- 2011年
- 目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。
- 辛毅许秀芳黄益民张颖李温斌
- 关键词：心肌成纤维细胞原代培养免疫荧光
- An in vivo model of in situ implantation using pulmonary valved conduit in large animals under off-pump condition被引量：1
- 2013年
- WU HaoXU Zhi-weiLIU Xian-minGONG DaWAN Ju-yiXU Xiu-fangZHOU Zi-fanLI Wen-bin
- 关键词：大型动物
- 小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及生物学特性被引量：3
- 2013年
- 目的探讨适用于小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)分离培养及鉴定的技术方法。方法采用机械研磨肾脏组织分离肾小管节段并结合Ⅱ型胶原酶消化分离培养法进行mRTECs原代培养,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;锥虫蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法、DNA周期检测法分别测定和观察mRTECs传代成活率、生长情况及增殖特征;免疫荧光染色法鉴定细胞。结果获得的细胞3 d后从贴壁的肾小管节段边缘长出,7 d后呈铺路石样,生长迅速可传代;传代细胞成活率达96%以上;第1代(P1)、第3代(P3)细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示P1、P3细胞生长至第3～5天光密度值变化较明显;随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,光密度值无明显变化,细胞逐渐衰老;P1细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为78.9%和21.1%,P3细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为82.1%和17.9%;P3细胞行免疫荧光染色细胞角质蛋白-18及上皮型钙黏素显示细胞质内蛋白表达阳性,细胞阳性率均达98%。结论机械研磨并结合Ⅱ型胶原酶消化培养法能成功培养mRTECs,建立稳定、高效的细胞分离和培养技术方法,为肾脏疾病与心血管功能相关性研究提供理想的细胞来源。
- 白蓉唐辛徐进许秀芳李温斌
- 关键词：肾小管上皮细胞原代培养生物学特性小鼠
- 戊二醛固定的异种血管的先天性免疫机制研究
- 2015年
- 目的:系统进行戊二醛固定的异种血管的免疫学研究及其动物在体排斥反应强度。方法:实验分两组:新鲜未处理组和戊二醛固定组。每一组分术后第4天、12天、30天和60天四个时间点。分别通过对20例新鲜猪肺动脉、20例戊二醛固定的异种血管进行大鼠皮下包埋,在术后第4天、12天、30天和60天进行观察,利用病理学和免疫组织化学等技术,全面系统比较了两组病理学、巨噬细胞CD68、补体C3、先天性抗体Ig G形态性变化及其IOD值变化。结果:HE染色结果显示新鲜组在术后第12天、30天染色较强,戊二醛组以上指标术后第12天、30天染色比新鲜组较弱。CD68、C3、Ig G值变化结果相似;免疫组织化学累积光密度(Integral optical density,IOD)定量检测结果显示:IOD值术后第4天开始升高,到第12天、30天达到峰值,第60天维持或下降。结论:先天性免疫在探索异种免疫排斥机理有重要作用;戊二醛固定的异种血管免疫原性下降,但是仍然具有免疫原性,需要探索更好的方法来削弱排斥反应。
- 张颖龚达辛毅崔巍刘洁琳万居易刘飒李殿坤杜兰平辛志飞许秀芳李温斌
- 关键词：免疫组织化学先天性免疫
- 人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究被引量：10
- 2013年
- 目的探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSC）的体外分离培养鉴定方法及多向分化潜能。方法应用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法及组织贴块培养法对hUCMSC进行体外培养。在倒置显微镜下观察不同方法获得的hUCMSC的生长特点；台盼蓝法测定细胞传代成活率；采用生长曲线、MTT法测定hUCMSC的增殖、流式细胞术（FCM）测定细胞周期变化及细胞免疫表型变化；采用相应试剂盒鉴定其向成脂细胞、成骨细胞的分化，采用免疫荧光细胞化学技术检测向成心肌样细胞的分化、采用荧光标记技术检测hUCMSC向血管内皮细胞的分化。结果酶消化法分离培养的细胞1d后，在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈圆形生长，4d后生长迅速呈长梭形，7d后由中心向周围生长且增殖明显，10d后达80％融合即可传代；贴块法培养的细胞7d后，可见细胞从组织块边缘长出，10d后细胞数量逐渐增多，16d后细胞生长迅速呈单层致密排列即可传代，细胞传代成活率均为96％以上。2种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTr法显示3～5d细胞增殖较明显；酶消化法培养的细胞G0／G1期和s＋G2／M期所占比例分别为88．78％和10．21％，组织贴块法培养的细胞G0／G1期和S＋G2／M期所占比例分别为84．82％和13．87％，细胞DNA周期无明显差异；2种方法获得的细胞经FCM检测CD90、CD105、CD73阳性率均为99％以上为高表达；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA—DR低表达；2种方法获得的细胞在体外诱导都能向成骨细胞、成脂细胞、成心肌样细胞及血管内皮细胞分化，其诱导阳性率均为90％以上。结论酶消化法和贴块法均可高效获得hUCMSC，与贴块法培养相比较，酶消化法能更有效的获得扩增迅速、细胞成分单一的细胞。
- 辛毅李娜黄益民崔巍刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：人脐带间充质干细胞原代培养诱导分化
- 成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性被引量：3
- 2012年
- 目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法。方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养。在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达。结果:酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4 d后,可见细胞从组织块边缘长出,7 d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97%。两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似"S"形、MTT法显示3～5 d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61%和30.87%,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24%和28.05%;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期。两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性。结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养。与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞。
- 辛毅刘飒许秀芳李温斌黄益民罗毅周玉杰
- 关键词：成年小鼠生物学鉴定
- 主动脉根包裹手术治疗主动脉根部动脉瘤被引量：2
- 2016年
- 目的：开发一个相对简单有效、手术风险较小的主动脉根部包裹术,以治疗主动脉根动脉瘤。方法：自2008年6月至2014年12月,25例主动脉根部瘤患者接受主动脉根部包裹术,其中合并主动脉瓣狭窄和/或反流者23例。主动脉瓣环的直径22-32mm,平均（26.30±3.45）mm,主动脉窦的直径45-62mm,平均（52.23±6.87）mm。所有患者进行主动脉根部包裹术,同时合并主动脉瓣成形术或置换术23例。结果：25例围手术期无死亡。CBP时间为55-128min,平均（81.56±15.43）min。出院前超声心动图检查结果显示：5例主动脉瓣轻度反流,20例主动脉瓣功能正常,与术前超声心动图结果对比,术后主动脉环直径21-25mm,平均（22.43±1.35）mm,较术前显著减小（P〈0.01）,主动脉窦直径30-52mm,平均（40.56±4.21）mm,显著减小（P〈0.001）。随访结果：所有25例患者生存良好,心脏功能（NYHA）均恢复I级,近中期无死亡病例。结论：主动脉根部包裹术结合主动脉瓣成型或置换术是一种外科手术治疗主动脉窦动脉瘤和主动脉瓣疾病新方法。
- 周子凡师启众刘现民李鲁安卓翌周海波曹劝省宋士秋刘岸新李温斌
- 关键词：主动脉瓣病变
- 小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及生物学特性被引量：7
- 2013年
- 目的:探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞的生物学特性。方法:以多聚赖氨酸对培养皿作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法,结合内皮细胞专用培养基,分离培养微血管内皮细胞并进行扩增。利用倒置显微镜观察细胞生长情况;台盼蓝法、绘制生长曲线和MTT法分别测定心肌微血管内皮细胞传代成活率、不同代生长及增殖特征;以DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标,结合CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定细胞表面特异性抗原;体外血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功能。结果:酶消化、差速贴壁法分离培养2 d后,细胞呈散在的、小簇状聚集性生长,4～5 d迅速生长呈单层排列,细胞为梭形、三角形或多角形,7～8 d后呈铺路石样即可传代;传代细胞经台盼蓝法检测成活率均为95%以上;第1、3代细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示第1、3代细胞在第2～4 d吸光度变化较明显(P<0.05);随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,吸光度无明显变化,细胞逐渐衰老;DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标阳性率为(89.2±3.5)%,相关特异性抗原CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定阳性率为(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%;体外血管形成实验显示,6～12 h后出现明显的管腔结构。结论:以多聚赖氨酸作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁法并结合内皮细胞专用培养基,可获得纯度较高的小鼠心肌微血管内皮细胞,为心脏疾病的研究提供种子细胞。
- 辛毅许秀芳黄益民张颖李温斌李娜
- 关键词：心肌微血管内皮细胞原代细胞培养生物学特性小鼠
