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小干扰RNA治疗头颈鳞癌的基础研究: 近年来,RNA 干扰技术作为一项新的基因阻断技术得到了快速的发展,在肿瘤基因治疗中具有很大的潜力。就头颈鳞癌而言,目前也已经开展了大量的基础研究工作。这些研究主要集中在应用各种小干扰 RNA(如 siRNA、shRNA)...; 陈始明陶泽璋王燕肖伯奎陈伟徐勇; 文献传递

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究被引量：5: 2007年; 目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐.用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用.结果:DNA序列与Gen-Bank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用.结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.; 胥文春曹炬许颂霄罗进勇朱旦尹一兵; 关键词：疫苗

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响被引量：6: 2008年; 目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响。方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEG-FP-shTERT。将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAPPCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达。结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后,端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05)。结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程。; 沈永忠王燕陈始明肖伯奎苏俊陶泽璋; 关键词：PCNA蛋白 CASPASE-3蛋白

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究被引量：8: 2005年; 目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内。以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Westernblot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达。结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降。细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制。体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制。结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考。; 刘丹陶泽璋陈始明肖伯奎; 关键词：HTERT RNAI 头颈部肿瘤鳞状细胞基因治疗

短发夹RNA抑制Hep-2细胞hTERT基因表达的实验研究: 目的探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法构建针对hTERT的mRNA干扰质粒pshRNA1、pshRNA2及对照质粒pshRNA3、pshRNA4,并...; 陈始明陶泽璋肖伯奎刘剑锋; 文献传递

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究被引量：2: 2005年; 目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用.方法根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3.构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4.实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液).酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1～3.采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA 法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用.结果(1)质粒pshRNA1～3 SalⅠ酶切后电泳见400 bp小带,与预期插入的目的基因大小一致.共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光.(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0.159±0.039、B组细胞活性为0.163±0.028、E组细胞活性为1.512±0.076.A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0.01.同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高.结论 (1)靶向hTERT mRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染 Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡.; 陈始明陶泽璋肖伯奎潘松刘丹池花明; 关键词：端粒末端转移酶双链RNA

短发夹RNA抑制喉癌细胞hTERT基因表达及诱导细胞凋亡被引量：1: 2006年; 目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达及诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法:构建靶向hTERTmRNA的质粒pshRNA1、pshRNA2及对照质粒pshRNA3、pEGFP,并将其分别转染喉鳞癌Hep-2细胞。共聚焦荧光显微镜观察质粒转染及表达情况;RT-PCR测定hTERTmRNA表达;Western印迹测定hTERT蛋白表达;末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性;MTT法研究细胞增殖活性变化;原位细胞凋亡(TUNEL)及透射电子显微镜研究细胞凋亡。结果:①共聚焦荧光显微镜下见大量的细胞呈现绿色荧光,与其他组比较,pshRNA1、2组呈现荧光的死亡细胞显著增加。②pshRNA1、2转染细胞后hTERTmRNA及hTERT蛋白表达显著降低;其端粒酶活性明显受到抑制:转染后2 d pshRNA1组活性为:0.159±0.039、pshRNA2组活性为0.163±0.028,与空白对照组1.523±0.076比较,差异有非常显著性(P<0.005)。③pshRNA1、2转染细胞后可显著抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。这两组细胞透射电镜可见典型细胞凋亡特征。结论:DNA载体途径的RNA干扰技术能有效抑制hTERT基因的表达及端粒酶活性并诱导癌细胞凋亡,此法可能成为抑制肿瘤细胞的新途径。; 陈始明陶泽璋池花明刘丹李志华詹汉章; 关键词：端粒末端转移酶 HEP-2细胞端粒酶逆转录酶

肺炎链球菌蛋白质疫苗研究进展被引量：3: 2007年; 肺炎链球菌是引起肺炎、中耳炎、脑膜炎等的重要致病菌。目前投入使用的荚膜多糖疫苗有很大的局限性，因此针对其主要毒力因子的蛋白质疫苗发展很快，有望替代多糖疫苗。; 曹炬尹一兵; 关键词：链球菌肺炎蛋白质类疫苗

短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响: 2007年; 目的：观察靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）生长增殖的影响，探讨靶向hTERT的RNA干扰技术临床应用的安全性。方法：根据RNA干扰原理，利用构建的表达shRNA的靶向hTERT mRNA的真核表达质粒（shRNAl），非特异性的shRNA真核表达质粒（shRNA2），转染试剂（德国metafectene）和正常培养液处理细胞。24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况；24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖活性；48h后进行HE染色、RT—PCR及端粒酶活性检测。结果：①共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光。②相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异（P〉0．05）；HE染色发现，同等培养条件下。各组细胞生长密度及形态无明显变化。③RT—PCR显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达；端粒酶活性为阴性。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响，该方法对不表达hTERT的正常体细胞可能是安全的。; 程杰陶泽璋肖伯奎段洪刚陈始明; 关键词：HTERT RNA干扰骨髓间充质干细胞基因治疗

抑制端粒酶逆转录酶基因表达对C-myc蛋白表达的影响被引量：1: 2005年; 目的:探讨应用RNA干扰技术抑制Hep2细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Cmyc蛋白表达的影响。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1,随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA2,采用METAFECTENE作为转染试剂。分别以质粒pshRNA1、pshRNA2及空白培养液处理喉癌Hep2细胞。应用RTPCR法检测hTERT基因的表达,WesternBlot法检测hTERT和Cmyc蛋白表达水平。结果:质粒pshRNA1转染组hTERTmRNA及蛋白表达水平显著低于其他处理组及空白对照组(P<0.05);质粒pshRNA1转染组Cmyc蛋白表达水平显著高于其他处理组及空白对照组(P<0.01)。结论:RNA干扰抑制人端粒酶逆转录酶活性使喉癌Hep2细胞Cmyc蛋白表达升高,其确切的机制有待进一步研究。; 池花明陶泽璋陈始明肖伯奎詹汉章; 关键词：端粒酶逆转录酶基因表达喉肿瘤 C-MYC蛋白

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国家自然科学基金(30471873)

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