山西省自然科学基金(2006021045)
- 作品数：6 被引量：14H指数：2
- 相关作者：向川卫小春刘君林树忠邢学武更多>>
- 相关机构：山西医科大学第二医院太原市中心医院更多>>
- 发文基金：山西省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达
- 2010年
- 背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤。目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响。方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞。载体经PLNCX2HindⅢ/NotⅠ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX2-RFP。转化生长因子β1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX2-RFP连接,构建PLNCX2-TGFβ1-RFP。包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度。将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX2组、转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化。收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β1表达。结果与结论:重组基因PLNCX2-TGFβ1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2-TGFβ1-RFP。转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×106CFU。稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功。持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃。转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX2组间差异无显著性意义。对照组与转染PLNCX2组均无转化生长因子β1表达,转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组转化生长因子β1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L。提示反转录病毒载体PLNCX2介导的人转化生长因子β1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃。
- 林树忠刘君向川卫小春
- 关键词：反转录病毒转化生长因子Β1转染软骨细胞软骨组织工程
- 逆转录病毒载体介导的白细胞介素-1Ra基因体外转染兔膝关节软骨细胞表达的研究
- 2009年
- 目的探讨运用重组逆转录病毒载体介导白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其在关节软骨细胞中的表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响。方法将构建含有目的基因的表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP体外转染到兔膝关节软骨细胞,采用一氧化氮(NO)检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中hIL-1Ra的表达情况。结果酶切和测序表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP;稳定转染软骨细胞后免疫荧光倒置显微镜观察到绿色荧光,证明转染成功;培养液中NO含量检测发现基因转染组比非基因转染组高,并且差异有统计学意义(P<0.05);ELISA检测发现基因转染组有一定量的hIL-1Ra表达,未转染组与空载体组均无基因表达,基因转染组与非基因转染组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论逆转录病毒载体PLNCX2介导的IL-1Ra能有效地转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃。为目的基因IL-1Ra转染治疗骨关节炎提供了理论基础。
- 林树忠刘君向川卫小春
- 关键词：逆转录病毒科白细胞介素转染软骨细胞
- 同步化法处理软骨细胞后对病毒转染效率影响的研究被引量：1
- 2008年
- 目的探讨同步化法对反转录病毒转染软骨细胞效率的影响。方法将构建并经过包装后的反转录病毒载体转染到经低温处理后的同步化兔膝关节软骨细胞,运用免疫荧光显微镜观察荧光显色,并用硝酸还原法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,并与非同步化转染组对照,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养液中人白细胞介素-1受体(hIL-1Ra)的表达量,与非同步化的细胞上清液中hIL-1Ra的含量做空白对照。结果酶切鉴定重组基因正确;免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色;同步化组上清液中NO含量为(145±3)μmol/L,非同步化组上清液中NO含量为(89±3)μmol/L;同步化组上清液中的hIL-1Ra的含量为(65±4)ng/L,明显高于非同步化组上清液中的hIL-1Ra的含量(41±3)ng/L(P<0.05)。结论软骨细胞经同步化后能显著提高反转录病毒载体的转染效率。
- 刘君向川卫小春
- 关键词：软骨细胞逆转录病毒科转染同步化
- 骨转换生化标志物及其应用研究进展被引量：10
- 2009年
- 骨重建是一个骨吸收和骨形成的过程,而该过程中的骨吸收和骨形成分别由破骨细胞和成骨细胞介导。骨转换加速是骨代谢疾病发生的重要原因,细胞活动耦联的中断伴随骨转换加速过程。在过去几十年中,一直致力于对可以反映骨转换的生化标志物的研究。大量研究表明,血清或尿液中的生化标志物与骨丢失率和骨折风险相关,这对于高风险患者的确定有重要意义。笔者对近年来骨转换生化标志物及其临床应用研究进展进行综述,特别关注其在药物功效的临床试验和骨量测量的补充这两方面的应用。有针对性地运用生化标志物可以进一步优化高风险患者的确定、药物开发的过程以及骨质疏松症治疗疗效的临床监测。虽然生化标志物有各种各样的变异性,但必将以其无创性、易重复性和及时性的优点而被广泛运用。
- 邢学武向川卫小春
- 关键词：骨密度骨质疏松症
- 不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究
- 2008年
- 目的探讨不同加样方法对逆转录病毒转染软骨细胞效率的影响。方法将构建并包装好的逆转录病毒重组基因PLNCX2-IL-1Ra—GFP分别采用以下加样转染方法进行转染并作对照研究，a）第1组：先加病毒上清，6h后补充培养液．b）第2组：先加病毒上清，隔夜补充培养液；c）第3组：先加病毒上清，6h后更换成培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6h后更换成培养液；d）第4组：先加病毒上清，6h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6h后补充培养液；e）第5组：经典转染法，同时加病毒上清液和培养液。转染2d后免疫荧光显微镜下观察荧光显色，4周稳定转染后分别检测各组细胞培养液中NO含量，并用ELISA法检测上清液中hIL-1Ra的表达情况。结果酶切鉴定重组基因正确；免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色；1～5组NO含量以第4组为最高，第5组为最低；ELISA检测1～5组培养液中hIL-1Ra的含量以第4组为最高，第5组为最低。结论四种不同加样转染方法的转染效率均高于经典法，其中以第4组为最好。
- 刘君向川卫小春
- 关键词：逆转录病毒转染效率
- 逆转录病毒载体介导的白细胞介素-1受体拮抗剂和转化生长因子-β1联合基因体外转染兔膝关节软骨细胞表达的研究被引量：3
- 2013年
- 目的运用重组逆转录病毒载体介导白细胞介素-1受体拈抗剂（IL-1Ra）和转化生长因子-β1（TGF-β1），分别和共同体外转染兔膝关节软骨细胞，观察其在关节软骨细胞中的表达及其对软骨细胞生物学性状的影响。方法构建含有目的基因的表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP，分别和联合体外转染到兔膝关节软骨细胞，采用NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中hlL-IRa和hTGF-β1的表达。结果成功构建真核表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP并稳定转染软骨细胞；培养液NO含量检测基因转染组[hlL-1Ra：（92．15±5．36）μmol／L．；hTGF-β1：（89．71±5．43）μmol／L；hlL-1Ra＋hTGF-βl：（94．93±4．88）μmol／L]均比空载体组（60．19±4．68）μmol／L和空白组（57．23±4．29）μmol／L高，差异有统计学意义（P〈0．05），基因转染组间差异无统计学意义（P〉0．05），非基因转染组间差异无统计学意义（P〉0．05）；ELISA检测发现基因转染组均有一定量hlL-1Ra和hTGF-β1表达，空白组与空载体组均无基因表达，基因转染组与非基因转染组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），单基因转染组和联合基因转染组问差异无统计学意义（P〉0．05）。结论逆转录病毒载体PLNCX2介导的IL-1Ra和TGF-β1能有效的转染到兔膝关节软骨细胞并获得一定程度表达，转染后的软骨细胞增生活跃。
- 向川刘君卫小春耿俊海
- 关键词：逆转录病毒转化生长因子-Β1软骨细胞
