国家自然科学基金(30471751)
- 作品数：11 被引量：65H指数：5
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- 携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建
- 2009年
- 目的探讨构建携带hIGF-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性。方法从pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ。鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ)。再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度。将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的条带,Western blot得到7.6kDa大小的目的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达。结论成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体。
- 高共鸣范卫民刘瑞平卫积书马益民
- 关键词：腺病毒载体转染
- 壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种支架体外构建组织工程软骨的比较研究被引量：10
- 2007年
- 目的观察兔关节软骨细胞在壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚羟基乙酸(PGA)三种细胞支架上的生长情况,探讨更适合构建工程软骨的细胞支架材料。方法多聚赖氨酸包埋壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种多孔海绵支架。将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于三种支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行大体标本观察和HE染色,检测软骨内DNA含量、Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的分泌量。结果软骨细胞在壳聚糖支架内生长良好,培养4周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌Ⅱ型胶原和GAG的能力较其他两种支架好(P<0.01)。结论壳聚糖支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架。
- 欧阳彬范卫民马益民刘锋
- 关键词：软骨细胞细胞支架壳聚糖
- 周期性压力对大鼠软骨细胞ERK1、ERK2的影响被引量：2
- 2010年
- 目的探讨周期性压力对大鼠软骨细胞细胞外信号调节激酶(ERK)1和ERK2的影响。方法将软骨细胞置于压力为150kPa,频率为0.1Hz的周期性应力系统中。分为四组:A组不加压作为对照;B、C和D组分别加压0.5、1和2h。用细胞免疫荧光法观察磷酸化ERK1和ERK2(pERK1和pERK2)在软骨细胞内的定位表达,同时用Westernblot法检测ERK1和ERK2在软骨细胞内的磷酸化。结果加压组的软骨细胞内pERK1和pERK2的荧光强度较A组明显增强;C组的荧光强度最大。pERK1和pERK2在B、C、D组内的表达较A组增高(P<0.01)。结论适当的压力刺激可导致软骨细胞内pERK1和pERK2表达增高,ERK1和ERK2可能在软骨细胞将压力信号转导为生物化学信号过程中起重要作用。
- 汤继磊殷国勇范卫民农鲁明任科伟
- 关键词：软骨细胞细胞外信号调节激酶
- 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达被引量：3
- 2008年
- 目的研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达。方法将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA3.1质粒上,经FuGENE6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照。转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Westernblot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318bp处见到相应的目的条带,而对照组未出现目的条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05)。免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒。Westernblot显示转染组细胞在7.6KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有。结论FuGENE6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：关节软骨细胞
- 不同材料包埋的PGA支架对软骨细胞体外培养的影响被引量：5
- 2006年
- 目的比较不同材料包埋的聚羟基乙酸(PGA)作为支架体外构建组织工程软骨的效果。方法采用卵磷脂、多聚赖氨酸及纤维粘连蛋白分别包埋PGA支架,并与软骨细胞一起体外培养,观察其亲水性的变化、对细胞生物学行为及合成细胞外基质的影响。结果以纤维粘连蛋白包埋的PGA支架具有良好的亲水性,改善细胞生物学行为,并显著增强细胞合成细胞外基质的能力。结论以纤维粘连蛋白包埋的PGA作为软骨组织工程技术中的支架材料,具有较大的应用前景。
- 孙晋客刘锋范卫民
- 关键词：聚羟基乙酸纤维粘连蛋白
- 骨-关节软骨复合组织块构建的实验研究
- 2007年
- 目的探讨采用组织工程技术构建骨．关节软骨复合组织块的可行性。方法将分离、培养的第2代软骨细胞和成骨细胞分别接种于磷酸三钙支架上，培养2周后通过物理方法将两者连接成一个整体，然后接种于裸鼠皮下。术后8周取材，行组织学观察。结果复合组织块在体内分别形成软骨组织和成骨组织，而且两者界面整合良好。结论以软骨细胞和成骨细胞为种子细胞、以磷酸三钙为支架体外构建的组织工程软骨和骨，可在体内形成组织工程骨．关节软骨复合组织块，有望用于关节软骨缺损的修复。
- 范卫民崔维顶张广程
- 关键词：成骨细胞软骨
- 周期性压力对组织工程软骨的影响及其作用机制被引量：31
- 2006年
- 目的探讨周期性压力对组织工程软骨的影响及其作用机制。方法取3个月龄新西兰兔关节软骨细胞,培养至第4代后,将软骨细胞随机分为两组。一组为压力组,即关节软骨细胞在周期性压力下培养；另一组为对照组,关节软骨细胞在常规条件下培养。采用组织化学、免疫组织化学观察周期性压力对组织工程软骨的结构以及Ⅱ型胶原分泌的影响。采用激光共聚焦显微镜观察周期性压力对软骨细胞内游离钙离子浓度变化的影响。结果周期性压力下培养的组织工程软骨与常规条件下培养的组织工程软骨相比,支架内软骨细胞数量多、排列规则,Ⅱ型胶原丰富,而且软骨细胞内游离钙离子浓度明显高于对照组。结论周期性压力能够通过增加细胞内游离钙离子浓度来促进软骨细胞的增殖,刺激软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原等细胞外基质。
- 范卫民蔡俊
- 关键词：软骨细胞钙离子
- 循环应力对构建组织工程软骨的影响被引量：2
- 2006年
- 目的探讨循环应力对体外构建组织工程软骨的影响。方法分离兔关节软骨细胞,体外扩增培养后种植于PGA无纺网支架上。实验组在循环应力下培养(0～200kPa,0.1Hz),对照组静态培养。实验组和对照组均培养4周。4周后取出组织工程软骨行大体标本观察。组织化学和免疫组织化学染色观察组织工程软骨结构以及Ⅱ型胶原分泌情况。结果体外培养4周时,实验组的组织工程软骨形态和色泽更加接近正常透明软骨,厚度和组织弹性优于对照组,实验组的软骨细胞数量和细胞外基质合成明显增加,分泌Ⅱ型胶原能力更强。结论循环应力刺激软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原增加,有利于在体外构建组织工程软骨。
- 蔡俊范卫民刘锋
- 关键词：软骨细胞循环应力
- 腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染对构建组织工程软骨的影响被引量：6
- 2009年
- 目的探讨腺病毒介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因转染对构建组织工程软骨的影响。方法分离新西兰大白兔关节软骨细胞,培养到第一代,用荧光标记的Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ转染,然后接种在PLGA支架上(转染组);未转染的软骨细胞接种在PLGA支架上(对照组),在体外培养2周。利用荧光显微镜、Western blot、RT-PCR、免疫组织化学等方法鉴定hIGF-Ⅰ基因的有效转染,并观察其对构建的组织工程软骨细胞外基质的影响。结果Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ能对兔关节软骨细胞进行有效转染,RT-PCR显示构建的组织工程软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组;定量检测显示胶原和GAG的含量高于对照组(P<0.01)。结论腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染能成功转染兔关节软骨细胞,用它构建组织工程软骨能显著促进软骨细胞外基质的合成。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：腺病毒软骨细胞
- 不同强度周期性压力对组织工程软骨的影响被引量：12
- 2007年
- 目的探讨不同强度的周期性压力对组织工程软骨的影响。方法将兔关节软骨细胞接种到聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上，随机分成四组，其中三组分别在压力强度为0～50kPa、0～100kPa、0～200kPa，频率0．1Hz的周期性压力下培养，另一组不加压，为对照组。2周后采用组织形态学、免疫组织化学法观察不同强度的周期性压力对组织工程软骨的结构及Ⅱ型胶原合成的影响．并定量检测组织工程软骨中氨基葡聚糖（GAG）的含量。结果在频率0．1Hz的周期性压力作用下，200kPa组支架内软骨细胞最多，排列规则，Ⅱ型胶原和GAG含量最高（P〈0．01）；100kPa组次之（P〈0．01）；50kPa组最差（P〈0．01）。三组加压组均优于对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论组织工程软骨细胞增殖和合成Ⅱ型胶原、GAG的能力受周期性压力强度的调控，其中频率0．1Hz、强度200kPa的周期性压力能更好地促进软骨细胞增殖，合成Ⅱ型胶原、GAG等细胞外基质。
- 岳海涛范卫民马益民张广程刘瑞平
- 关键词：软骨细胞
