国家自然科学基金(30471719)
- 作品数：14 被引量：45H指数：4
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- 肌肉转录调节因子和连接蛋白43基因表达对大鼠成纤维细胞分化的生长特性及生物学功能影响被引量：10
- 2007年
- 目的通过观察转染肌肉转录调节因子(myoblast determining,MyoD)基因和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因的大鼠成纤维细胞(fibroblast,FB)分化生长及生物学功能的改变,初步探讨MyoD和Cx43基因转染FB治疗缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的可能机制和途径。方法构建真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-MyoD和pLenti6/V5-DEST-Cx43,利用慢病毒表达系统,将MyoD和Cx43基因转入大鼠RFL-6FB;经终浓度为50μg/ml的Blasticidin进行筛选培养后,通过RT-PCR、Western blot等分子生物学手段确定MyoD和Cx43的转录和表达情况;借助免疫细胞化学、显微镜观察等手段对MyoD的肌肉特异性蛋白和Cx43连接蛋白进行检测,并观察转染后FB的生长情况。结果RT-PCR和Western blot检测出MyoD和Cx43基因转染后FB表达了相应mRNA及其蛋白,免疫细胞化学检测转染的FB细胞中Desmin、α-actin呈阳性表达。经分化培养基诱导,培养1周后,FB出现多细胞融合及肌管形成。结论MyoD及Cx43基因转染可改变FB的生物学特性,转向分化为成肌细胞,并能形成多核肌管及连接蛋白,形态学也得以证实,为进一步研究MyoD和Cx43基因转染FB治疗IHD提供了实验基础。
- 汪进益范慧敏刘中民李杨马亮
- 关键词：连接蛋白43基因转染慢病毒载体成纤维细胞
- 小鼠心梗模型的建立与无创评价被引量：17
- 2010年
- 目的建立小鼠的心肌梗死模型,提高动物存活率,并使用心脏超声进行无创心功能评价。方法昆明雄性小鼠20只,气管插管后由左侧第4肋间进胸,结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型,在模型建立的前1 d和术后1 d、1周分别使用心脏超声检测左室收缩末直径、舒张末直径、缩短分数和射血分数,并于术后第8天进行病理检查。结果小鼠心肌梗死模型建立过程中早期死亡率10%(2/20),术后1周内死亡率15%(3/20),经过超声评价,造模成功率为75%(15/20)。小鼠心功能明显下降,射血分数由手术前的(92.1±3.45)%下降到术后1周的(49.8±14.20)%,缩短分数由手术前的(61.4±2.85)%下降到(26.1±9.01)%;心室明显扩大,左室收缩末直径由(13.9±1.98)μm扩大到(36.5±7.37)μm,舒张末直径由(35.9±3.12)μm扩大到(48.9±6.05)μm。病理学检查见明显瘢痕形成。结论通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立了小鼠心肌梗死模型并可以使用超声心动图评价这一模型。
- 刘建范慧敏汪进益张治国曹浩兰琴史乾唐光亮刘中民
- 关键词：小鼠心肌梗死超声心动图
- 探讨生肌调节因子和连接蛋白43基因在大鼠成纤维细胞中的表达
- 2008年
- 目的通过观察转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin)基因的大鼠真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)生物学功能的变化,探讨Myo和Cx43基因转染DFs细胞的意义。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoDcDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western blot及膜片钳技术等方法检测MyoD及Cx43 mRNA及蛋白表达,并检测离子电流变化,通过显微镜观察转染后生长情况,免疫组织化学检测肌动蛋白和结蛋白的表达。结果RT-PCR,Western blot检测出MyoD及Cx43的mRNA及相应蛋白表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后,培养1周细胞的融合现象,并有多核肌管形成。免疫组织化学检测可见其下游蛋白Desmin及α-actin呈现阳性表达。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。
- 张旭敏范慧敏汪进益刘中民张文杰
- 关键词：连接蛋白43基因转染成纤维细胞心力衰竭
- 生肌调节因子和连接蛋白43基因诱导大鼠成纤维细胞分化为肌细胞实验研究
- 2008年
- 目的探讨转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin,Cx43)基因的大鼠真皮成纤维细胞(der-mal fibroblast,DFs)生物学功能的变化及MyoD和Cx43基因转染DFs细胞治疗心力衰竭的可行性。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoD cDNA和Cx43cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western印迹法等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mRNA表达情况,并且通过显微镜观察转染后生长情况,膜片钳技术检测离子电流变化。结果RT-PCR,Western印迹法检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后培养1w细胞的融合现象,并有多核肌管形成。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。
- 张旭敏李淑梅范慧敏刘中民张文杰汪进益
- 关键词：连接蛋白43基因转染成纤维细胞心力衰竭
- 脑钠素和心电图评价细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究被引量：2
- 2008年
- 目的探讨肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)基因和连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因体外共转染大鼠皮肤真皮成纤维细胞(dermal fibroblasts,DFs)后在心肌梗死部位原位移植修复梗死心肌组织的近期疗效及其安全性。方法60只SD雄性大鼠随机分成4组(n=15)。正常对照组:取100μl细胞培养液基质植入到正常心肌组织中;心梗对照组:取等量细胞培养液基质植入到心肌梗死大鼠瘢痕组织中;正常移植组:在正常心肌组织中植入等量用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记经MyoD和Cx43基因联合转染DFs细胞悬液;心梗移植组:在心梗后瘢痕组织中植入等量同样的细胞悬液,细胞密度均为2.0×106/ml。在细胞移植前、移植后4周内动态监测心电图和血浆脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)水平的变化。结果心梗对照组和心梗移植组血浆BNP浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P<0.01);心梗移植组较心梗对照组血浆BNP浓度在术后1 d、1周及2周无差异,在4周后明显降低(P<0.01)。心梗大鼠Ⅱ导联心电图的QRS波增宽,ST段、T波抬高;细胞移植早期ST段、T波快速回落,2周内回落大于50%;4周后正常移植组和心梗移植组大鼠均未见致命性心律失常,且心梗移植组与心梗对照组(或移植前)相比QRS波变窄,R波相对升高,ST段回到基线。结论用MyoD和Cx43基因转染DFs后原位心肌移植,可以降低血浆BNP水平和改善心电图,两者的动态监测为评价细胞移植治疗急性心梗提供了有效实用的方法。
- 汪进益范慧敏刘中民张旭敏马亮李杨
- 关键词：脑钠素心电图急性心肌梗死细胞移植
- 适用于Langendorff离体心脏灌流大鼠心肌梗死动物模型的建立被引量：6
- 2007年
- 目的建立适用于Langendorff离体心脏灌流大鼠心肌梗死的动物模型,为评价干细胞移植对急性心肌梗死后的心功能变化提供基础。方法选用Sprague-Dawley(SD)大鼠16只,结扎其左冠状动脉前降支中远1/3处,在结扎前后通过MPA多导生理记录仪连续描记心电图;4周后再次开胸进行Langendorff离体心脏灌流测定左室心功能和心肌组织病理学检查;另选仅开关胸后存活的10只SD大鼠作为对照组。结果造模成功率为62.50%(10/16);心电图动态监测在冠脉结扎后出现ST-T抬高的融合波,30 min后可见病理性Q波;4周后Langendorff离体心脏灌流装置系统检测显示左室收缩压峰值(LVSP)、左室内压等容相最大上升及下降速率(+dp/dtmax,-dp/dtmax)等指标较对照组降低,左室舒张末压峰值(LVEDP)则反之;病理组织切片可见结扎区域心肌纤维排列紊乱、坏死心肌被纤维组织取代。结论通过结扎左冠脉前降支的方法,4周后能够形成稳定的适用于Langendorff离体心脏灌流的心肌梗死动物模型,该模型能应用于干细胞移植对心脏功能影响的研究。
- 汪进益范慧敏刘中民
- 关键词：离体心脏心肌梗死动物
- 大鼠心肌成纤维细胞体外培养的生物学特性及转基因研究被引量：2
- 2008年
- 目的观察大鼠心肌成纤维细胞（CFs）体外培养的生长增殖情况及肌肉转录调节因子（MyoD）基因转染对其生物学特性的影响。方法采用改良的差速贴壁法培养大鼠CFs，利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6／V5-DEST-MyoD转导培养的大鼠CFs，用稻瘟菌素筛选2周，挑选转基因单克隆细胞，传代培养，进行细胞形态观察、生长曲线以及细胞免疫化学鉴定。结果成功建立高纯度大鼠CFs的细胞培养模型，且具有良好的细胞形态、正常的生长增殖等生物学功能。转染细胞的MyoD cDNA基因表达阳性，其下游抗α-肌动蛋白（α-actin）呈阳性表达，胞质呈棕黄色，并且含有与细胞纵轴平行排列的肌丝，细胞核用苏木素复染后呈淡蓝色。在2．0×10^5／mL细胞密度的CFs接受转MyoD基因后，抗α-actin阳性率为（27．04±9．41）％。结论真核表达载体成功介导MyoD cDNA转导入体外培养的大鼠CFs，诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞，CFs可成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。
- 汪进益范慧敏刘中民卢蓉马亮李杨
- 关键词：心肌成纤维细胞细胞培养转基因靶细胞
- 肌肉转录调节因子和连接蛋白43转基因成纤维细胞移植对心肌梗死大鼠脑钠素及梗死面积的影响
- 2008年
- 背景:研究表明基因工程将成纤维细胞改造为可兴奋细胞是可能的;而真皮成纤维细胞是机体内数量最大的"种子细胞库"。目的:观察肌肉转录调节因子(myogenic determination,MyoD)和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因共转染真皮成纤维细胞后在心肌梗死部位原位移植对急性心肌梗死大鼠血浆脑钠素浓度和心肌梗死面积的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-03在同济大学附属东方医院细胞治疗室和上海中医药大学动物实验中心完成。材料:雄性SD大鼠60只随机分成正常对照组、心肌梗死对照组、正常移植组和心肌梗死移植组,每组15只。方法:结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。4周后再次开胸在自结扎远端紧靠结扎处,心肌梗死区与非梗死区交界处用微量注射器将100μL经BrdU标记的MyoD/Cx43-FB细胞悬液(细胞数1.0×106)注入左冠状动脉前降支,在结扎远端已缺血的心肌上用同样的针头于靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上多点多位置将另外100μL移植细胞悬液注入到心肌内,深度约4mm;对照组同法等量注入未含细胞的DMEM细胞培养液。主要观察指标:细胞移植前和移植后1d,1,2,4周动态检测血浆脑钠素浓度;同时监测各组大鼠心率、动脉压、左心室内压及左心室等容收缩期室内压最大上升速率和下降速率等血流动力学指标的变化;4周后处死大鼠取心肌标本染色后测定心肌梗死面积。结果:①免疫组织化学检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在。②细胞移植可显著改善心肌梗死大鼠的血流动力学。③心肌梗死对照组和心肌梗死移植组大鼠的血浆脑钠素浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P<0.01);在移植后1d、1周、2周心肌梗死移植组与心肌梗死对照组血浆脑钠素浓度差异无显著性意义,4周后明显降低(P<0.01)。④心肌梗死移植组�
- 汪进益范慧敏卢蓉张旭敏马亮李杨刘中民
- 关键词：CX43基因心肌梗死脑钠素心肌梗死面积
- MyoD和Cx43基因转染成纤维细胞后心肌移植治疗大鼠心肌梗死
- 2008年
- 本研究旨在观察肌肉转录调节因子（MyoD）和连接蛋白43基因（Cx43）体外转染真皮成纤维细胞（DFs）诱导其分化为“心肌样”肌细胞（MyoD／Cx43-DFs）后，经心外膜途径移植对急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌结构和心功能的影响。一。
- 范慧敏汪进益刘中民马亮符雪莲李扬王军臣
- 关键词：真皮成纤维细胞基因转染CX43MYOD
- MYo Cx43基因转染大鼠成纤维细胞产生电偶联能力细胞实验研究被引量：1
- 2008年
- 目的通过观察转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin)基因的大鼠真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)生物学功能的变化,探讨Myo和Cx43基因转染DFs细胞在治疗心律失常中意义。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoD cDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR、Western blot及膜片钳技术等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mR-NA表达情况及离子电流变化,并且通过显微镜观察转染后生长情况,免疫组织化学检测肌动蛋白和结蛋白的表达。结果RT-PCR,Western blot检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达,显微镜观察到基因转染筛选后,培养1周细胞的融合现象,并有多核肌管形成及连接蛋白形成。免疫组织化学检测可见其下游蛋白Desmin及α-actin呈现阳性表达,膜片钳检测到转染后钙离子及钠离子电流改变。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为可兴奋偶联细胞,为进一步研究基因治疗心律失常奠定基础。
- 张旭敏范慧敏刘中民汪进益张文杰
- 关键词：连接蛋白43基因转染成纤维细胞
