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骨骺干细胞的体外培养及生长特性被引量：9: 2006年; 目的:观察体外培养大鼠骨骺干细胞及其生长特性。方法:采用显微取材后酶消化获取骨骺干细胞,用Percoll密度梯度离心法纯化,并测定其细胞生长曲线、细胞分裂指数、碱性磷酸酶活性,用免疫组化及免疫荧光染色的方法检测Ⅱ、Ⅹ型胶原的合成情况和透射电镜观察粗面内质网的丰富程度。结果:大鼠骨骺干细胞形状类似成纤维细胞,呈梭型,碱性磷酸酶活性低,粗面内质网少,Ⅱ型胶原合成量较多。结论:体外培养的骨骺干细胞能向成熟阶段分化,可为软骨或骨组织工程提供理想的种子细胞。; 张衣北陈安民郭风劲黄仕龙熊文化; 关键词：骨骺干细胞细胞培养细胞分化

免疫分选软骨前体细胞并诱导永生化的研究被引量：14: 2007年; 目的建立永生化大鼠软骨前体细胞株，为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用免疫磁珠技术分离纯化具有特异性表面标志成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）的软骨前体细胞，用基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的重组质粒pEGFP-IRES2-SV40Tag转染原代培养的新生大鼠软骨前体细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3、Ⅱ型胶原和X型胶原抗体进行细胞鉴定，检测其分化能力，观察细胞的形态及其生长状况，绘制生长曲线。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Southern blot和免疫细胞化学法鉴定SV40Tas在转染细胞中的表达。结果获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学证实为FGFR-3阳性的具有较强增值能力和多分化潜能的软骨前体细胞。经Southern印迹杂交证实，SV40Tag已稳定转染入软骨前体细胞，表达mRNA及其蛋白。贴壁培养的永生化软骨前体细胞株（IPSC），群体倍增时间为23．62h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论SV40Tag导入可诱导软骨前体细胞永生化，为软骨前体细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源。; 郭风劲陈安民黄仕龙; 关键词：永生化

正弦波电磁场对鼠骨骺干细胞分化的生物学影响被引量：13: 2006年; 目的研究50Hz正弦波电磁场对大鼠骨骺干细胞分化的生物学影响。方法取生长良好的第4代骨骺干细胞,随机分为实验组和对照组,实验组采用50Hz正弦波电磁场间断刺激。分别绘制2组细胞生长曲线,MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western Blot法检测细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)的表达,并进行定量分析。结果曝磁早期细胞增殖活性的改变不明显,正弦波电磁场刺激4d和6d能明显促进细胞的增殖,2组OD值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组骨骺干细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均明显降低(P<0.05),PTHrp蛋白的表达增强。结论适当参数的工频正弦波电磁场能促进骨骺干细胞PTHrp蛋白的表达,从而调节其增殖能力,增强分化稳定性,抑制细胞凋亡。; 黄仕龙陈安民郭风劲李新志罗正强张衣北; 关键词：电磁场细胞分化甲状旁腺激素相关肽

Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察被引量：18: 2005年; 目的研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。方法向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167),空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流式细胞仪、碱性磷酸酶染色和Western印迹方法检测。结果骨骺干细胞中有Notch1和Jagged1表达;与对照组相比,rhNF-κB诱导组表达PCNA、胶原Ⅱ蛋白明显增多,促细胞增殖作用明显(P=0.027),并且进入分裂期(S期)的细胞增多(26.54%),而MW167诱导组碱性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表达明显增多,胶原Ⅱ蛋白及分化标志蛋白stathmin表达明显减少。结论当Notch信号系统被激活时,骨骺干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,骨骺干细胞进行分化。; 张衣北陈安民郭风劲黄仕龙熊文化李琪; 关键词：干细胞细胞分化骨骺

Effect of Stathmin Decoy-oligodeoxynucleotides on the Proliferation and Differentiation of Precartilainous Stem Cells被引量：2: 2007年; By using decoy-oligodeoxynucleotides （decoy-ODNS） technique, the effects of Stathmin gene on the proliferation and differentiation of in vitro cultured precartilainous stem cells （PSCs） were investigated. The Stathmin decoy-ODNs were transfected into PSCs in rats by using gene transfection technique. Under the induction of cortisol （1 μmol/L）, electrophoretic mobility shift assay was used the inhibitory effects of decoy-ODNS on Stathmin gene. MTT and cytometry were used to test the cell proliferation. The expression of collagen Ⅱ and Ⅴ and Stathmin protein was detected by using Western blot. The results showed that Stathmin decoy-ODNs inhibited the Stathmin activity in a dose-dependent manner. When the concentration of decoy-ODNs was 10 times of standard con- centration, the proliferation of PSCs was obviously suppressed and the differentiation happened. Compared to the control group, the difference was significant （P〈0.05）. It was concluded that decoy-ODNs could inhibit the proliferation and promote the differentiation of PSCs by antagonizing Stathmin activity.; 郭风劲张衣北陈安民; 关键词：DIFFERENTIATION

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体被引量：3: 2005年; [目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。; 黄仕龙陈安民郭风劲张衣北; 关键词：基因真核表达载体增殖鼠骨甲状旁腺激素相关蛋白 DNA序列测定区细胞

激活的Notch1信号系统抑制前软骨干细胞凋亡及其机制研究被引量：5: 2006年; 目的研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的前软骨干细胞(precartilainous stem cells,PSCs)凋亡及其机制。方法用RT-PCR检测PSCs细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ(MW167)和Bcl-2抑制剂HA 14-1,空白对照加PBS缓冲液,在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后,用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和Western Blot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。结果PSCs细胞中存在Notch1／Jagged1信号通路,rhNF-kB组细胞活力增加,凋亡较少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加,而MW167组、HA 14-1组和对照组细胞凋亡明显,差异有显著性意义(P<0．05),且HA 14-1组和HA 14-1协同rhNF-kB组无Bcl-2表达。结论激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制PSCs细胞凋亡。; 张衣北陈安民郭风劲黄士龙; 关键词：前软骨干细胞凋亡

甲状旁腺相关肽调控骨骺干细胞后的stathmin表达被引量：3: 2010年; 目的研究甲状旁腺相关肽全长及部分肽段PTHrp(107-139)对体外培养的骨骺干细胞的调控作用并检测调控后stathmin的表达。方法利用免疫磁珠分选细胞的方法,分离出原代骨骺干细胞。转化、提取、鉴定所需的三种质粒。用脂质体介导法将质粒转染入骨骺干细胞,通过G418筛选得到抗性克隆并将其分别扩增培养,并加入1.0g/ml的强力霉素进行诱导,并设置空白对照。转染后第4小时以及24、72、96小时对各组细胞用Western-blot检测stathmin的表达水平,并抽提各组细胞的RNA进行逆转录,然后通过RT-PCR的方法检测细胞内stathmin的mRNA表达变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果Tet-on基因表达系统能准确的调控骨骺干细胞中的基因表达。质粒转染后骨骺干细胞数量明显增多。PTHrp全长及部分肽段质粒转染实验组,其骨骺干细胞中stathmin的蛋白水平和mRNA水平均逐渐增加,且增高程度大致相当,空白对照组无明显变化。结论甲状旁腺相关肽及其肽段PTHrp(107-139)均可能有促进骨骺干细胞增殖的作用,stathmin在调控中出现高表达,提示细胞增殖。[关键词]甲状旁腺相关蛋白;骨骺干细胞;; 周治国李丽郭风劲; 关键词：甲状旁腺相关蛋白骨骺干细胞 STATHMIN

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国家自然科学基金(30371439)

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