霍英东青年教师基金(91029)
- 作品数：6 被引量：29H指数：3
- 相关作者：肖少波陈焕春方六荣江云波潘永飞更多>>
- 相关机构：华中农业大学广州医学院第二附属医院中山大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：霍英东青年教师基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究
- 2009年
- 目的构建人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）病毒蛋白22（VP22）及microdystrophin基因融合表达重组质粒，体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性，为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症（DMD）奠定基础。方法从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pAVX1中，构建重组质粒pAVP22；再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒，获得microdystrophin基因，片段回收后定向插入质粒pAVP22中，获得重组质粒pAVP22-MICDYS；然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞，通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达；最后收集转染后3T3细胞上清。感染人间充质干细胞（MSCs），检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdystrophin融合蛋白的转导。结果成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒，并在体外得到了很好表达；同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率。并可介导VP22-microdystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCs间的转导。结论该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础。
- 熊符张成陈松林郑卉肖少波潘永飞于美娟冯善伟卢锡林
- 关键词：蛋白转导
- 伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究被引量：11
- 2007年
- UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。
- 张辉方六荣赵骞薛念波江云波肖少波陈焕春
- 关键词：伪狂犬病毒突变株生物学特性
- 与α疱疹病毒VP22蛋白融合增强“自杀性”DNA疫苗的免疫反应被引量：8
- 2006年
- α疱疹病毒VP22具有独特的蛋白转导特性,能通过一种不依赖于高尔基体的非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导.因此,VP22是一种极具开发潜力的免疫增强分子.本研究以牛疱疹病毒1型(BHV-1)的VP22为研究对象,以β-半乳糖苷酶(β-gal)为模式抗原,构建了BHV-1VP22(BVP22)与β-gal融合的“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCAB-gal,转染BHK-21细胞.X-gal染色结果表明,表达的融合蛋白BVP22-gal仍具有蛋白转导能力,而单独表达β-gal的“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCA-gal不具有这种能力.进一步将pSCAB-gal和pSCA-gal分别免疫BALB/c小鼠,结果pSCAB-gal免疫能显著增强β-gal特异性ELISA抗体和细胞毒T细胞(CTL)活性,表明与BVP22融合能显著增强“自杀性”DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫反应.
- 肖少波方六荣姚琳潘永飞江云波陈焕春
- 关键词：蛋白转导
- 伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的克隆、序列分析及表达
- 2008年
- 从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。
- 张辉肖少波方六荣牛传双陈焕春
- 关键词：伪狂犬病病毒
- 牛疱疹病毒Ⅰ型VP22和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合基因DNA疫苗的免疫效应被引量：10
- 2005年
- 为了提高表达GP5的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗的免疫效应,将具有蛋白转导功能的牛疱疹病毒1型(BHV1)VP22基因插入到经过修饰具有更好免疫原性的PRRSV修饰型ORF5基因(ORF5M)上游,构建VP22和ORF5M融合表达的真核表达质粒pCIVP22ORF5M。经间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblot检测证实体外表达后,免疫BALBc小鼠,检测小鼠免疫后的GP5特异性ELISA抗体、抗PRRSV中和抗体和脾淋巴细胞增殖反应,并与非融合的真核表达质粒pCIORF5M进行比较。结果显示,融合表达VP22GP5的DNA疫苗pCIVP22ORF5M诱导的体液免疫和细胞免疫反应均明显高于非融合表达的DNA疫苗pCIORF5M,表明蛋白转导相关蛋白BHV1VP22能显著增强表达GP5的PRRSVDNA疫苗的免疫效应,有效发挥了基因免疫佐剂效应;这为研制PRRSV高效DNA疫苗奠定了基础,同时也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。
- 赵武肖少波方六荣江云波宋云峰严琳余晓岚陈焕春
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白转导DNA疫苗
- 伪狂犬病毒UL14基因缺失影响病毒的增殖和细胞间扩散
- UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV -Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测、荧光观察...
- 张辉肖少波方六荣赵骞薛念波陈焕春
- 关键词：伪狂犬病毒突变株生物学特性
- 文献传递
- 伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析被引量：1
- 2006年
- 以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间。上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础。
- 姚琳方六荣肖少波潘永飞谢京国陈焕春
- 关键词：伪狂犬病毒缺失突变体亚细胞定位
