国家自然科学基金(81101782)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
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- 相关机构：第三军医大学大坪医院重庆医科大学中国科学院更多>>
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- 人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1基因siRNA慢病毒载体的构建与鉴定被引量：5
- 2013年
- 目的构建人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1(Breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)基因siRNA慢病毒载体,并进行鉴定。方法针对人BCAR1基因靶序列设计并合成4条siRNA序列(PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353)及1条阴性对照序列(PLVT4),分别退火后,插入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的慢病毒载体pMagic 4.1中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,经PCR和DNA测序筛选阳性克隆,提取重组干扰质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞,进行慢病毒包装,浓缩后,采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,筛选干扰效果最好的重组慢病毒感染肺癌A549细胞,Western blot检测BCAR1蛋白的表达水平。结果成功构建了4种人BCAR1基因慢病毒干扰质粒,PLVT350、PLVT351、PLVT352和PLVT353的病毒滴度分别为3.45×108、2.13×108、3.01×108和2.47×108TU/ml;慢病毒感染3 d后,A549细胞的感染效率均达90%以上;除PLVT350外,其他3个均为有效靶点,PLVT351、PLVT352和PLVT353的沉默率分别为82%、73%和82%,BCAR1基因的表达量显著低于未转染和PLVT4组A549细胞(P<0.001);PLVT351感染的A549细胞中BCAR1蛋白的表达水平明显低于未感染和PLVT4组A549细胞(P<0.01)。结论成功构建了人BCAR1基因siRNA慢病毒载体,并建立了稳定表达的A549细胞株,为进一步探索BCAR1基因在肺癌中的相关功能及其分子机制奠定了基础。
- 黄伟范小青王如文邓波蒋耀光赵云平郭伟
- 关键词：RNA干扰慢病毒肺癌A549细胞
- 乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1在食管鳞癌血清和组织中的表达及临床意义被引量：4
- 2012年
- 目的探讨乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1（BCAR1）在食管鳞癌血清和组织中的表达及临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测2010年2月至2011年1月间46例食管鳞癌患者和25例正常人血清BCAR1水平；应用组织芯片和免疫组织化学方法检测2004年2月至2006年7月问106例食管鳞癌和癌旁正常组织中BCARl表达。结果食管鳞癌组BCAR1血清水平显著高于正常对照组（P〈0．01）；晚期食管鳞癌BCARl血清水平显著高于早期食管鳞癌组和正常对照组（P〈0．01）；切除肿瘤后，血清BCARl水平有逐渐下降趋势。BCAR1蛋白在食管鳞癌组织中阳性率为97％（103／106），癌旁正常食管组织中有16例弱阳性，阳性率为15％（16／106），两者差异有统计学意义（P〈0．01）；BCAR1阳性表达与食管鳞癌的分化明显相关（P〈0．05），与年龄、性别、淋巴结转移、浸润深度和TNM分期明显无关（P〉0．05）。生存分析提示BCARl高表达组生存时间少于低表达组（P〈0．01）；经COX模型多因素生存分析，显示BCARl表达和淋巴结转移为独立预后因素。结论食管鳞癌血清和组织中BCARl水平显著高于正常对照组，并与疾病进展、治疗效果、分化程度和预后相关，可作为食管鳞癌诊断和判断预后重要新的肿瘤分子标记。
- 黄伟邓波王如文蒋耀光谭群友范小清
- 关键词：食管鳞癌组织芯片
- mIL-21-hIgGFc融合蛋白在293E细胞中的表达纯化及其对CD8^+T细胞表型的影响
- 2014年
- 目的:在293E细胞中表达小鼠IL-21-hIgGFc融合蛋白,并检测该蛋白对CD8+T细胞表型的影响。方法:运用RT-PCR方法从BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞扩增出IL-21基因,插入到PTT3-hIgGFc载体上,获得重组质粒PTT3-mIL-21-hIgGFc;用磷酸钙瞬时转染293E细胞,48 h和72 h后分别收集培养上清。培养上清经MOLLIPORE LabscaleTMTFF system浓缩后,Protein G琼脂糖柱纯化获得mIL-21-hIgGFc融合蛋白,再用ELISA和SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的含量和纯度。mIL-21-hIgGFc刺激P1A小鼠的CD8+T细胞,72 h后,运用流式细胞术检测其表型改变情况。结果:重组质粒PTT3-mIL-21-hIgGFc经酶切和测序确定载体构建成功,ELISA检测表明293E细胞上清中含有787 ng/ml,SDS-PAGE结果显示得到了较纯的融合蛋白,纯化后获得500μg融合蛋白mIL-21-hIgGFc。融合蛋白mIL-21-hIgGFc处理P1A小鼠CD8+T细胞后,CD44lowCD62Lhi CD8+T细胞明显增多。结论:我们成功构建了PTT3-mIL21-hIgGFc重组质粒,在293E细胞中表达并纯化出mIL21-hIgGFc融合蛋白。mIL21-hIgGFc能促进CD8+T细胞向CD44lowCD62LhiCD8+记忆干细胞表型分化,这对于肿瘤过继免疫治疗方案的改进具有重要的参考意义。
- 黄启彬刘明月符少月邢巧刘潇淇王盛典易发平
- 关键词：表达纯化CD8^+T细胞
