国家自然科学基金(39670013)
- 作品数：8 被引量：42H指数：4
- 相关作者：罗进贤张添元卢文菊李文清张晓实更多>>
- 相关机构：中山大学广州医学院中山医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- 用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素(英文)被引量：16
- 2004年
- 为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9K。将人血管抑制素 (AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点 ,获得含AS基因的重组质粒 pGAP9K AS。转化P .pastorisGS115 ,对获得的高拷贝转化子P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)进行组成型表达 ,同时以诱导型转化子P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)作为对照。SDS PAGE结果显示 :组成型转化子于培养 4d后AS的表达水平已达到高峰 ,分泌量为 5 8mg/L ;而诱导型转化子诱导 4d后表达的AS仅是组成型表达的 70 % ,诱导 6d后达到高峰 ,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时 (4d)的 86 %。CAM分析和抗癌实验结果显示 :P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)和P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C5 7BL/ 6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长 ,其平均瘤重抑制率分别达到 90 6 1%和 90 5 4 %。以上结果表明 ,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点 ,PGAP可以取代PAOX1在P .pastoris中表达AS及其他外源蛋白。
- 张爱联罗进贤张添元陈守才官文俊
- 关键词：组成型表达毕节酵母GAP启动子抗血管生成抗肿瘤
- 重组人血管抑素的纯化和生物活性鉴定被引量：4
- 2001年
- 目的：纯化大肠杆菌表达的重组人血管抑素（ｒｈＡＧＮ）并鉴定其抗血管生成生物活性。方法：通过超声破碎、包涵体洗涤、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶过滤层析等步骤初步纯化ｒｈＡＧＮ，Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白浓度，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析观察其纯度；应用 ＭＴＴ法观察在终浓度为 ０．１～３．０ ｍｇ／Ｌ范围内 ｒｈＡＧＮ对 １０ μｇ／Ｌ ＥＧＦ刺激的人真皮微血管内皮细胞系ＨＤＭＥＣ的增殖抑制活性；以ＰＢＳ为对照（ｎ＝５），应用原位鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）技术观察１００ μｇ／只（ｎ＝５）和２００ μｇ／只（ｎ＝５）ｒｈＡＧＮ作用７２ ｈ对３０ｎｇ ｂＦＧＦ 诱导的鸡胚ＣＡＭ毛细血管生成的抑制作用。结果：①ｒｈＡＧＮ电泳纯度达到 ９６％，总回收率为 ６１．７％；②ｒｈＡＧＮ对 ＨＤＭＥＣ细胞增殖的最大抑制剂量约为 ２．０ ｍｇ／Ｌ，抑制率约９２．３％．半数最大抑制剂量在１．０ ｍｇ／Ｌ附近；③１００ μｇ／只和２００ μｇ／只ｒｈＡＧＮ组鸡胚ＣＡＭ 载样滤纸片下毛细血管数目分别为７９±２３条和３７±１１条，两组间比较差异显著（Ｐ＜０．０５）；与对照组（１４５±３６条）相比，均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论：ｒｈＡＧＮ达到了较高的电泳纯度，
- 卢文菊张晓实罗进贤陈柏铭
- 关键词：血管抑素重组蛋白质类纯化生物活性
- 人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中的表达被引量：2
- 1999年
- 将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白的528%.
- 陈广南罗进贤卢文菊张添元
- 关键词：人纤溶酶原基因表达大肠杆菌
- 人血管生成抑制素基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达被引量：5
- 2000年
- 血管生成抑制素是新发现的一种血管生成抑制因子,能抑制肿瘤的生长和转移,有临床应用前景。根据血管生成抑制素是纤溶酶原的一个内片段的特点,以人纤溶酶原cDNA为模板,用PCR扩增出人血管生成抑制素基因,经序列分析后克隆至质粒pBV220转化大肠杆菌DH5α,在温度诱导下获得高效表达。SDS-PAGE及Western印迹分析显示:表达产物占菌体总蛋白的38％,相当于212mg/L,并具有免疫活性。生物活性分析结果表明,重组人血管生成抑制素能抑制bFGF诱导的CAM血管生成、抑制C57BL/6小鼠皮下原位B16黑色素瘤生长。
- 罗进贤卢文菊李文清张添元罗学斌
- 关键词：血管生成抑制素基因克隆肿瘤基因表达
- 全文增补中
- 人血管抑素cDNA在酿酒酵母中的表达和分泌
- 2000年
- 目的 :在酿酒酵母中表达和分泌人血管抑素。方法 :应用DNA重组技术构建重组质粒 ;质粒DNA转化酵母用醋酸锂法 ;以纤溶酶原抗血清为第一抗体 ,采用ELISA方法检测表达产物。结果 :将MFα1信号肽和人血管抑素融合基因序列插入酵母表达载体pMA91的Bg1Ⅱ位点 ,构建了重组表达质粒 pMAA2 ,转化酿酒酵母GRF18后获得工程菌GRF18(pMAA2 ) ,其培养上清液ELISA分析阳性。结论 :人血管抑素在GRF18(pMAA2 )中得到表达 ,产物分泌至细胞外 ,能够与纤溶酶原抗血清发生特异的免疫反应。
- 卢文菊罗进贤刘向辉张朝琴陈柏铭
- 关键词：血管抑素基因表达分泌酿酒酵母
- 人血管抑制素在酿酒酵母中的分泌表达和活性鉴定被引量：4
- 2002年
- 将酵母交配因子 (MF)α1信号肽编码序列和人血管抑制素 (hAGN)cDNA融合序列插入穿梭载体pYADE4 ,构建得到分泌型重组表达质粒pYADEMA18.转化酿酒酵母JG110 7后 ,用 2 %乙醇和2 %甘油联合诱导表达 .ELISA分析表明 ,在诱导 14h～ 30h期间 ,hAGN获得了表达并分泌至细胞外 .发酵上清液经 75 %饱和度硫酸铵沉淀、CM 5 2纤维素离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析纯化 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物重组人血管抑制素 (rhAGN)相对分子质量约 5 0kD ,电泳纯度达到 94 %.生物活性分析证明 ,rhAGN在 0 0 1mg L～ 3 0mg L浓度范围内能够抑制人真皮内皮细胞株HDMEC增殖 ,抑制作用随剂量的增加而增强 .
- 卢文菊罗进贤张晓实李文清
- 关键词：酿酒酵母分泌表达活性鉴定
- 人纤溶酶原K1-3区基因在大肠杆菌中的表达被引量：5
- 2001年
- 将人纤溶酶原kringle 1- 3 (K1- 3)基因插入融合表达载体pET - 17b ,获得重组质粒pET -K13 ,转化E coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下 ,人纤溶酶原K1- 3基因在E coliBL2 1(DE3,pET -K13)中获得高效融合表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 4% ,表达产物以包涵体存在 ,Westernblot证明重组蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性 .
- 陆幸妍盛节张添元罗进贤
- 关键词：基因表达大肠杆菌WESTERNBLOT肿瘤血管生成抑制素
- 人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究被引量：9
- 2000年
- 目的 :探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素 (rhAGN)的影响。方法 :应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及 pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果 :(1)工程菌E .coliDH5α(pBVA2 )在 30℃培养至A60 0nm 为 0 .3～ 0 .5时于 4 2℃诱导4hrhAGN表达量最高 ,约为 2 12mg L ;(2 ) 15L发酵罐发酵参数为 pH7.2 ,搅拌转速 50 0r min ,通气量 4～ 8L min ,溶氧 50 %时 ,rhAGN表达量提高到 2 76mg L。结论 :确定了最适诱导时机和诱导时间 ,通过调节 pH和改善通气 ,初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺。
- 卢文菊罗进贤何建国张添元
- 关键词：人血管抑素基因表达大肠杆菌发酵
