国家自然科学基金(30371309)
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
- 相关作者：李小鸥王宏伟杨渝珍阎媛黄巍更多>>
- 相关机构：华中科技大学华中科技大学同济医学院附属同济医院武汉大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组TACE前肽蛋白对小鼠内毒素血症抑制作用的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的建立小鼠内毒素血症模型,观察肿瘤坏死因子前体转换酶(TACE)前肽结构域对其催化结构域的自身抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法首先利用DNA重组技术分别构建含前肽结构域和催化结构域的重组载体:用PCR方法扩增出TACE的胞外结构域(T1300)和前肽结构域(T591),并克隆至载体pET-28a(+)中,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白,两者均为包涵体,变性复活后经Ni2+-NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行Western印迹分析。构建TACE信号肽+前肽结构域(T648)的真核表达质粒(pEGFP-N1/T648),将其瞬时转染HeLa细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达观察pEGFP-N1/T648转染后在细胞中分布情况。建立小鼠内毒素血症模型组,前肽重组蛋白治疗组和PBS对照组,通过流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-α的表达,并取肝,肺,肾组织行HE染色,观察纯化的前肽蛋白对炎症的抑制作用。结果成功构建了pEGFP-N1/T648真核表达载体,在体外转染HeLa细胞,可见荧光主要分布在细胞膜上。流式细胞技术证明重组前肽蛋白可明显对抗LPS诱发的sTNF-α分泌增加,使小鼠腹腔巨噬细胞膜表面mTNF-α增加,常规病理切片HE染色显示该蛋白可降低LPS诱发的小鼠肝,肾,肺组织的炎症反应。结论TACE前肽重组蛋白降低了sTNF-α的分泌,对炎症有明显的抑制作用,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
- 李小鸥阎媛周玉杨渝珍王宏伟
- 关键词：肿瘤坏死因子Α抑制剂
- 肿瘤坏死因子前体转换酶前肽结构域对TACE活性调节作用被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨肿瘤坏死因子前体转换酶(TACE)的前肽结构域在TACE成熟过程中所起的作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法:以pIRES2-EGFP质粒为载体,利用DNA重组技术分别构造含信号肽结构域+前肽结构域、全长结构域及缺失前肽结构域的真核表达重组体,根据其碱基数目分别命名为pIRES2-EGFP/T648、pIRES2-EGFP/T2472、pIRES2-EGFP/T57-T1824;真核转染U937细胞;LPS刺激转染细胞后,用ELISA法及流式细胞技术检测TNF-α。结果:pIRES2-EGFP/T648的真核表达能显著抑制TACE的活性,减少sTNF-α分泌,抑制率达61.09%;pIRES2-EGFP/T57-T1824的真核表达对sTNF-α的分泌无影响;pIRES2-EGFP/T2472的真核表达能显著增加sTNF-α分泌。结论:前肽结构域在TACE的成熟过程中起了双重作用,TACE抑制剂的研制和开发为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
- 李小鸥阎媛黄巍杨渝珍王宏伟
- 基质金属蛋白酶活性测定进展
- 2010年
- 生物体内基质金属蛋白酶(MMPs)的检测及其抑制剂的活性评价,都需要可靠的MMPs活性测定方法。目前测定MMPs活性的方法主要有3种:底物胶电泳酶谱法、酶联免疫法和高效液相色谱法,此外荧光淬灭缩氨酸底物法以及比色法也广泛应用于测定MMPs活性。本文就目前常用的测定MMPs活性的方法进行综述。
- 凌青余谨赵云斌杨渝珍
- 关键词：基质金属蛋白酶酶联免疫吸附测定比色法
- 重组TACE前肽对自身TACE活性的抑制作用被引量：1
- 2008年
- 目的以脂多糖（LPS）刺激人单核细胞型淋巴瘤细胞株THP-1为模型，观察重组肿瘤坏死因子α转换酶（TACE）前肽结构域对催化TACE结构域的自身抑制作用，为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法首先利用DNA重组技术分别构造含前肽结构域和催化结构域的重组载体：用PCR方法扩增出TACE的胞外结构域（T1300）和前肽结构域（T591），并克隆至载体pET-28a（＋）中，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白，两者均为包涵体，变性复活后经Ni^2＋ -NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行Western blot分析。LPS分时相刺激THP-1细胞后，用细胞学技术观察纯化的T591在蛋白质水平上对TACE的表达和活性的影响。结果TACE重组前肽蛋白能显著抑制TACE的活性，减少分泌型TNF-α（sTNF-α）分泌，抑制率达57％。结论TACE重组前肽抑制了TACE的活性，降低了sTNF-α的分泌，为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
- 李小鸥阎媛黄巍杨渝珍王宏伟
- 关键词：肿瘤坏死因子Α抑制剂
- 两类金属蛋白酶在炎性细胞模型中的变化及中药RDQ的天然抑制效应(英文)
- 2007年
- 目的探讨金属蛋白酶(MPs)家族的MMPs和ADAMs两亚类成分在前体TNF-α(mTNF-α)向成熟型TNF-α(sTNF-α)转化过程所起的作用,MMPs在炎症过程中活性的变化和中药RDQ抗炎保护功效的分子机制,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法以LPS刺激HL-60细胞为天然模型,用细胞学和分子生物学技术在蛋白质和mRNA水平上研究MMPs、ADAM17、TNF-α在炎症过程中的表达和活性变化。结果①LPS刺激后,HL60细胞上清中MMPs的活性随刺激时间延长逐渐减弱,胞浆裂解物中的MMPs则随刺激时间延长活性增加但LPS刺激对MMPs mRNA的表达影响不大;②LPS刺激能使HL-60细胞中ADAM17mRNA和TNF-αmRNA表达在6h同时达高峰;③RDQ能明显降低LPS诱导的ADAM17 mR- NA的增加,并能抑制sTNF-α的分泌。结论①ADAM17对sTNF-α的产生起主导作用;②纯中药注射液热毒清(RDQ)能调节TACE的表达,最终抑制TNF-α的分泌。
- 李小鸥闫媛王震王开富杨渝珍王宏伟
- 关键词：肿瘤坏死因子脂多糖金属蛋白酶热毒清
