国家高技术研究发展计划(2001AA217181)
- 作品数：10 被引量：41H指数：4
- 相关作者：陈方平吴小兵彭建强夏昆薛京伦更多>>
- 相关机构：中南大学复旦大学863计划生物领域病毒基因载体研发基地更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划霍英东基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子IX基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达。方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rAAV-2/GFP)感染SW480/C26细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率。rAAV-2/hFIX感染SW480/C26细胞,检测hFIX基因、FIXAg量及hFIX活性的表达。结果:SW480细胞株/C26细胞株GFP48hr阳性率分别为(57.0±8.5)%和(48.0±5.7)%;转导组14 d和21 d均可见外源hFIX的cDNA片断。SW480细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天和第21天ELISA法测hFIX抗原量分别为(98.0±4.3)和(30.9±6.5)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.7±0.1)ng.106cell-1.24h-1。C26细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天测hFIX抗原量为(78±5.12)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.9±0.1)ng.106cell-1.24h-1。hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关。较对照组亦显著增高。结论:rAAV-2/GFP能有效地转导SW480/C26细胞。rAAV-2/hFIX能有效地转导SW480/C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。
- 马泳泳陈方平杜建伟陈焱彭建强吴小兵解勤之
- 关键词：血友病B基因治疗法重组腺相关病毒结肠上皮细胞
- yCDgly TK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE-2细胞株放射增敏作用的研究被引量：12
- 2005年
- 目的研究yCDglyTK融合自杀基因前药系统对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的放射增敏作用。方法pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-1yCDglyTK质粒经电穿孔法转染CNE2细胞,给予不同剂量γ射线照射及不同剂量前药,通过免疫组化、高效液相色谱、细胞存活率测定(MTT法)及克隆增殖实验,观察不同剂量辐射对自杀基因阳性CNE-2细胞中自杀基因表达及功能的影响,并观察前药干预及γ射线对CNE-2细胞生长的影响。结果电离辐射可诱导增强自杀基因阳性细胞株中yCDglyTK基因的表达;电离辐射与前药的联合大大增强了对自杀基因阳性CNE-2细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独放射。结论yCDglyTK融合自杀基因前药系统对CNE-2细胞有放射增敏作用,其与放射联合使用对CNE-2细胞有明显协同杀伤效应。
- 张俊毅赵素萍肖健云夏昆唐爱发陈主初
- 关键词：放射增敏
- 人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达被引量：2
- 2008年
- 本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480,用RT-PCR检测mRNA的转录,荧光显微镜观察转染效率,ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明:转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录;荧光显微镜观察到48小时转染效率最高;ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为(11.34±0.23)ng/(106cells.24h),第48小时hFⅨ蛋白量最高,达(29.34±1.00)ng/(106cells.24h),转染后72小时降为(12.45±0.15)ng)/(106cells.24h)。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性,48小时达峰值(6.07±0.17)%/106cells,第72小时降至(1.81±0.06)%/106cells。结论:肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ,肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。
- 杜建伟陈方平夏昆文路宋永平
- 关键词：基因治疗
- 腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34^+造血干/祖细胞中的表达
- 2005年
- 目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达。方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21d,从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达,同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响。结果经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨcDNA片段,上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达,每24h分泌量达14.10ng/106细胞。转导组和未转导组细胞培养21d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论rAAV-2/hFⅨ能有效地转导人脐血CD34+细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,且对其体外培养21d的细胞增殖分化能力无明显影响。
- 陈焱陈方平彭建强吴小兵王光平蹇在伏信红亚吴新华
- 关键词：CD34^+造血干/祖细胞病毒载体介导脐血CD34^+细胞2型重组腺相关病毒
- 重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达被引量：3
- 2003年
- 为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体 FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMV△R8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒.重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达.重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/106细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低.将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d.上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.
- 陈晓光朱焕章李峰宫菊丽薛京伦
- 关键词：慢病毒介导CDNA基因治疗血友病
- 尾静脉大容量快速注射法介导的人凝血因子Ⅸ基因在小鼠肝内的高效表达被引量：6
- 2003年
- 尾静脉大容量快速注射裸质粒DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达,采用此方法将人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达质粒pCMV-hFⅨ2.2 mL于7 s内导入小鼠体内,hFⅨ在小鼠体内表达水平最高为2921 ng/mL(血浆).hFⅨ表达水平与裸质粒DNA注射剂量呈正相关,重复注射的hFⅨ表达水平偏低(最高1459 ng/mL).PCR检测发现小鼠多种器官中存在hFⅨ cDNA,RT-PCR和免疫组化切片检测表明,hFⅨmRNA和蛋白主要在肝脏中表达.转氨酶水平与病理切片检测表明,注射1 d后5％的肝脏细胞受到损伤,但在3～10 d内恢复.研究结果表明,尾静脉大容量快速注射法能够介导hFⅨ在小鼠体内高水平表达,为基因治疗研究提供了一项简便而实用的动物实验手段.
- 贺晨霞冯登敏陈立陈浩明姚纪花沈琦卢大儒薛京伦吴文君丁友法
- 关键词：基因转移裸质粒基因治疗血友病
- 靶向性质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV·Egr-1CDglyTK的构建及转染研究被引量：12
- 2003年
- 目的 构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK并进行转染研究。方法采用PCR、RT—PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK表达载体,成功转染鼻咽癌CNE—2细胞,绘制细胞相对存活率曲线,初步研究该载体在前体药物干预下对CNE—2细胞生长的影响。结果 表达pcDNAA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK的CNE—2细胞在5—FC/GCV干预下生长受到抑制。结论pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK可作为鼻咽癌基因治疗的载体。
- 唐瑶云肖健云赵素萍唐爱发夏昆陈主初
- 关键词：EGR-1启动子CDGLYTK
- 2型重组腺相关病毒对脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导条件的优化
- 2006年
- 目的:探索不同转导条件下2型重组腺相关病毒(rAAV-2)/绿色荧光蛋白(GFP)对人脐血CD34+细胞的转导效率。方法:人脐血CD34+细胞分别以IL-3加IL-6加干细胞因子(SCF)加Flt3配体(FL)(预刺激1组)或SCF加FL加血小板生长因子(预刺激2组)预刺激48 h后,转导rAAV-2/GFP,转导后2 d和7 d收集细胞,流式细胞仪检测GFP的表达,同时以金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK-21)细胞作为阳性对照。结果:感染复数(MOI)为2×105病毒基因组(v.g)/cell时,rAAV-2/GFP能有效地转导CD34+细胞,2 d的GFP阳性率可达(28.05±4.47)%(S/F/T组),(27.44±4.99)%(3/6/S/F组),最高达43.36%,随着培养时间的延长,GFP表达有下降的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。预刺激1组、预刺激2组与无预刺激组的GFP阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05),预刺激1组与预刺激2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MOI 2×105v.g/cell时,采用细胞因子预刺激可得到rAAV-2/GFP对人脐血CD34+细胞的有效转导,但本实验采用的2种预刺激条件对转导效率的提高没有明显区别。
- 陈焱陈方平王光平彭建强吴小兵吴新华
- 关键词：脐血造血祖细胞基因转导
- 结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ基因载体治疗血友病B的安全性研究被引量：1
- 2009年
- 目的分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFⅨ)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性。方法将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013 v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)抗体,并通过组织病理学、免疫组化和PCR技术分析病毒和hFⅨ的组织分布。结果灌注后,在小鼠体内能够检测到抗rAAV2抗体和抗hFⅨ抗体;组织病理学、免疫组化和PCR技术分析结果显示灌注部位肠组织无明显病理改变,rAAV2以及hFⅨ基因仅仅在灌注的肠上皮。结论结肠灌注重组腺相关病毒基因治疗血友病B小鼠,在所观测时间内是安全的。
- 彭捷王华陈方平王光平彭建强
- 关键词：重组腺相关病毒血友病B基因治疗结肠灌注安全性
- 腺相关病毒介导的小鼠IX因子在血友病B小鼠体内表达研究被引量：8
- 2003年
- 通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10^(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％,而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体,第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低。重复注射AAV/mFⅨ病毒后,不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌。以上结果显示,AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法。
- 陈立陈浩明陆华中吴小兵卢大儒邱信芳薛京伦
- 关键词：血友病B腺相关病毒小鼠单纯疱疹病毒
