国家自然科学基金(30671581)
- 作品数：9 被引量：15H指数：2
- 相关作者：林矫矫石耀军彭金彪傅志强洪炀更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所南京农业大学安徽农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估被引量：2
- 2010年
- 目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。
- 王艳郭凡吉彭金彪李晔洪炀陈实傅志强石耀军林矫矫
- 关键词：日本血吸虫抗原性免疫保护
- 日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆、表达及转录时相分析
- 2010年
- 目的构建日本血吸虫凝溶胶蛋白（Sjgelsolin）的原核表达载体，获得其表达产物并分析其在不同发育阶段的转录水平。方法根据序列AY814387设计引物，体外扩增Sjgelsolin的蛋白质编码序列，将其插入pET28a（＋）质粒，转化至大肠埃希菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。提取日本血吸虫虫卵，尾蚴，7-d童虫，42-d雌、雄成虫的总RNA，用半定量RT—PCR分析sjgelsolin在每个样本中的转录水平。结果成功构建了pET28a（＋）-Sjgelsolin重组质粒，并获得高水平的表达。Sjgelsolin转录子在尾蚴和雌虫成虫中未被检测到，而在7-d童虫和42-d雄虫成虫中被检测到。结论Sjgelsolin在体外获得表达，且其转录是受发育调控的。
- 汪勇沛詹永乐张磊朱传刚林矫矫
- 关键词：凝溶胶蛋白日本血吸虫
- 日本血吸虫Wnt受体蛋白Fz5编码基因的克隆及其在不同发育时期虫体的表达差异被引量：3
- 2008年
- 目的克隆含开放阅读框(ORF)的日本血吸虫SJCHGC08304全基因序列,分析此基因编码蛋白的Wnt受体种类,了解该基因在血吸虫不同发育阶段的mRNA表达差异。方法采用RACE技术从日本血吸虫7d肝期童虫和42d成虫组织中扩增获得日本血吸虫SJCHGC08304全基因序列,通过生物信息学工具分析该基因的完整ORF;同源性分析该基因编码蛋白的种类和功能;运用荧光定量PCR技术分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况。结果获得日本血吸虫新基因,该基因ORF含2604bp,编码867个氨基酸,理论分子量为98.264kD。实时定量分析该基因在18d童虫表达量最高,其他依次为14d童虫、42d雄虫、32d成虫、虫卵、23d成虫、27d成虫,而在42d雌虫中没有检测到该基因。结论该基因的氨基酸序列具有典型Wnt受体家族蛋白特征,生物信息学方法同源性分析表明与非洲爪蟾Fz5蛋白的同源性最高,通过比较分析推测为编码日本血吸虫Wnt受体Fz5蛋白基因,命名该基因为sjFz5基因(GenBank登录号:EU370926),其在血吸虫的不同发育时期中有不同程度的差异表达。
- 韩琳苑纯秀冯新港
- 关键词：日本血吸虫WNT信号通路
- 日本血吸虫mago nashi基因的克隆表达及其功能研究
- 2011年
- 以日本血吸虫18 d虫体的cDNA为模板,PCR获得Sjmago nashi编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为441 bp,将该序列提交至NCBI,登录号为GQ403668;应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况。结果表明:该基因在不同发育阶段均有表达,在13日龄童虫表达量相对最高,32日龄次之;在不同性别成虫虫体中,该基因在雄虫的表达量远高于雌虫,说明该基因为日本血吸虫性别发育差异基因。以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,在大肠杆菌中表达,表达产物分子质量为19.5 ku,并以Ni-NTA HisBind Resin纯化重组蛋白。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得25.94%的减虫率和30.01%的肝脏减卵率。
- 彭金彪韩宏晓洪炀王欣之石耀军傅志强刘金明林矫矫
- 关键词：日本血吸虫克隆表达免疫保护效果
- 日本血吸虫蛋白酶体α2亚基基因的克隆、表达及功能分析被引量：2
- 2010年
- 26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession No.AY813725),序列分析表明该基因的开放阅读框(ORF)含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。
- 洪炀韩宏晓彭金彪李晔石耀军傅志强刘金明李祥瑞林矫矫
- 关键词：日本血吸虫克隆免疫保护
- 日本血吸虫Sj CyclophilinA基因的克隆、表达及其生物学功能研究被引量：1
- 2010年
- 【目的】克隆和表达了日本血吸虫CyclophilinA(Sj CyPA)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,PCR扩增一EST序列的基因全长cDNA,提交到NCBI,登录号为GQ403666。应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达。诱导、表达、纯化和复性重组蛋白,测定其PPIase活性。利用Western blot检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。【结果】PCR获得了Sj CyPA编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为519bp。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在13d童虫表达量最高,为童虫期高表达基因。构建了重组表达质粒pET28a(+)-Sj CyPA,并在大肠杆菌中成功表达。复性重组蛋白具有PPIase活性。Western blot试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得18.72%的减虫率和44.6%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPA基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPA原核重组表达质粒,在大肠杆菌中成功表达,纯化复性得到有PPIase活性的Sj CyPA重组蛋白,并证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。
- 彭金彪韩宏晓洪炀王欣之石耀军傅志强刘金明林矫矫
- 关键词：日本血吸虫CYCLOPHILIN免疫保护效果
- 日本血吸虫SjPRMT1基因的克隆、表达及表达产物的免疫保护效果分析
- 2010年
- 【目的】克隆和表达日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1(SjPRMT1)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7d童虫消减cDNA文库中,获得一个EST序列,经序列测定和生物信息学分析命名为SjPRMT1,以SjcDNA为模板,获得其全长cDNA。荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况。以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果。【结果】获得了SjPRMT1编码基因的全长cDNA,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸。荧光实时定量PCR分析该基因在18d童虫高表达,13和23d次之。获得了SjPRMT1重组蛋白,其具有良好的抗原性和免疫原性。在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得35.07%的减虫率和48.66%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的SjPRMT1基因的全长cDNA,成功构建了pET28a(+)-SjPRMT1重组质粒,该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。
- 韩宏晓彭金彪洪炀王欣之石耀军傅志强刘金明程国锋李祥瑞林矫矫
- 关键词：日本血吸虫克隆免疫保护小鼠
- 日本血吸虫重组抗原SjPGAM-SjEnol的保护性免疫效果评价被引量：7
- 2010年
- 目的构建日本血吸虫重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol并在大肠埃希菌（E.coli BL21）中表达,观察重组抗原在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol富含人源（HLA）Ⅱ类、鼠源（H2-d）Ⅱ细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段,将对应编码的核苷酸序列进行拼接,构建重组质粒pET32a（＋）-SjPGAM-SjEnol,并在E.coli BL21中表达。用蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组抗原的抗原性。用小鼠实验评估重组抗原的免疫保护效果,即将55只雄性BALB/c小鼠均分成5组,其中3个试验组分别用重组抗原pET32a-SjPGAM-SjEnol（A组）、pET28a-SjPGAM（B组）、pET28a-SjEnol（C组）（各27μg）与206佐剂混合后免疫小鼠,每次间隔2周,共免疫3次。同时设佐剂对照组（D组）和空白对照组（E组）。末次免疫后2周,每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染后6周,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝虫卵数（EPG）,计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周尾部取血和剖杀时收集血清,应用ELISA检测血清特异性IgG抗体水平。结果确定SjPGAM的96~147、SjEnol的233~312肽段为重组片段。PCR扩增出一条含编码这两个肽段的核苷酸序列的重组DNA序列,大小447bp。获得的重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol相对分子质量（Mr）为33000。Westernblotting结果显示,该重组蛋白可被日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清识别,具有良好的抗原性。小鼠免疫实验结果显示,与空白组相比,A组获得39.7%的减虫率和64.9%的肝减卵率,其减虫率与B组（18.5%）、C组（14.7%）比较,差异有统计学意义（均P〈0.05）;肝减卵率与B组（47.5%）、C组（30.5%）比较,差异也有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。ELISA结果显示,第3次免疫后A组的特异性IgG抗体达到较高水平（2.372±0.268）,与D组（0.490±0.138）�
- 郭凡吉王艳李晔彭金彪洪炀邱春辉陈实傅志强石耀军林矫矫
- 关键词：日本血吸虫烯醇酶多表位疫苗免疫保护
- 日本血吸虫Sj Cyclophilin B基因的克隆、表达及免疫保护效果分析
- 2010年
- 本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B(Sj CyPB)编码基因的cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增其基因全长cDNA,提交序列到NCBI,登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,构建重组表达质粒,表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明,RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为672bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因,命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在18d童虫期表达量最高,32d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB,并在大肠杆菌中成功表达,表达产物分子量为49.5kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得31.5%的减虫率和41.01%的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中成功表达,证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。
- 彭金彪韩宏晓洪炀王艳郭凡吉石耀军傅志强刘金明程国锋林矫矫
- 关键词：日本血吸虫CYCLOPHILIN免疫保护效果
