国家自然科学基金(30371280)
- 作品数：12 被引量：18H指数：3
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- 嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究
- 2005年
- 构建HCVla/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达。结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCVNS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达。本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制。
- 吕欣徐志凯薛小平尹文雷迎峰杨敬孙梦宁
- 关键词：嵌合体体外转录脂质体转染
- HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达被引量：1
- 2006年
- 目的建立丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位基因的真核表达载体，并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段；分别合成HCV E2区模拟表位和NS3-NS57个T或Th细胞表位基因；PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA．3．1（-）-CtEm已成功转染COS7，间接免疫荧光和RT-PCR证实，pcDNA3．1（-）-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体，并在COS7细胞中瞬时表达，为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。
- 韦三华尹文雷迎峰胡兴斌吕欣杨敬孙梦宁徐志凯
- 关键词：丙型肝炎病毒表位转染
- HCV RNA复制过程中5'UTR与3'UTR作用的初步探讨
- 2005年
- 构建具有不同类型和长度的5'非编码区(UTR)及3'UTR的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆,体外转录制备RNA,转染肝癌细胞HepG2,研究不同RNA转录体在细胞内的复制情况。通过RT-PCR与Westernblot等方法证明:蛋白编码区来源于1a基因型并具有1b型5'UTR及3'UTR(全长或缺失98nt保守区)的2种嵌合型HCVRNA,都可以在病毒易感细胞中复制和表达;而以脑心肌炎病毒(EMCV)内核糖体进入位点(IRES)替代HCV5'UTR的嵌合型RNA转染细胞,检测不到病毒正、负链RNA与蛋白表达。以上结果说明HCV1b型5'UTR与3'UTR可以支持1a型病毒RNA的正常复制,3'UTR保守区的存在与否,对病毒复制影响不大。
- 吕欣徐志凯薛小平尹文雷迎峰杨敬孙梦宁韦三华胡兴斌
- 关键词：丙型肝炎病毒嵌合体
- HCV核心蛋白在HepG2细胞中对COX-2表达的影响被引量：3
- 2006年
- 目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是否影响环氧化酶-2(COX-2)的表达。方法用PCR从含HCVH77株全长基因组序列质粒中扩增HCV核心蛋白基因,并克隆至pcDNA3.1载体中,构建HCV核心蛋白基因的真核表达载体HCV-C/pcDNA3.1。用HCV-C/pcDNA3.1和含COX-2启动子的荧光素酶报告载体COX2pro1.5kb/luc瞬时共转染HepG2细胞,测定萤火虫荧光素酶的活性,并用Westernblot检测COX-2蛋白的表达水平。结果成功地构建了HCV-C/pcD-NA3.1重组质粒。瞬时转染后的HepG2细胞中,COX2启动子荧光素酶的活性显著增强。Westernblot检测,发现COX-2的表达明显升高。结论HCV核心蛋白在HepG2细胞中激活COX-2启动子,并且明显诱导COX-2的表达,为进一步研究COX-2与HCV致病性的关系提供了新的实验依据。
- 刘艳丽闫岩白文涛张芳琳吕欣张伟徐志凯
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白环氧化酶-2
- 丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
- 2005年
- 目的:建立截短的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达。方法:应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过脂质体转染至CHO细胞。结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1-C t,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3.1-C t在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论:成功构建羧基端部分缺失的HCV C区基因的真核表达载体,瞬时转染CHO细胞,为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗(BCG)活载体疫苗奠定基础。
- 韦三华尹文雷迎风胡兴斌吕欣杨敬孙梦宁徐志凯
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白
- HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体的构建及其体外转录制备感染性RNA的研究
- 2006年
- 运用重叠延伸PCR方法对HCV全长基因组cDNANS3和NS5A上的E1202G、T1280I和S2197P进行细胞培养适应性突变,构建含有细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA,体外转录制备RNA,脂质体法转染人肝癌细胞Huh-7,以RT-PCR检测HCV正、负链RNA,间接免疫荧光法和Westernblot检测细胞内HCVNS3蛋白的表达。结果证明,转染后细胞内可间断检测到HCV正、负链RNA及HCVNS3蛋白的表达,且突变体RNA与未突变的HCVRNA相比,明显具有更高的复制效率和蛋白表达。该研究为后续HCV体外培养体系的研究提供了可在细胞内高效自主复制的HCV病毒模板。
- 孙梦宁薛小平尹文吕欣雷迎峰韦三华胡兴斌杨敬
- 关键词：丙型肝炎病毒突变体细胞培养
- 稳定表达HCV 1a NS5A和NS5A-ΔISDR细胞株的构建
- 2005年
- 以pBRTM/HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5a、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ/EcoRⅠ、XhoⅠ/HindⅢ和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP-N3中,构建重组质粒pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-ΔISDR。对重组质粒进行酶切分析和序列测定。将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定。经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR。RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达。以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-ΔISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCVNS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料。
- 廖继佩薛小平徐志凯尹文雷迎峰吕欣杨敬
- 关键词：干扰素敏感决定区HELA细胞系增强型绿色荧光蛋白真核表达载体
- 运用重叠PCR技术构建HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体被引量：5
- 2006年
- 目的:构建含有不同组合细胞培养适应性突变的丙型肝炎病毒(HCV)全长基因组cDNA。方法:根据HCV全长基因组cDNA序列及突变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法对ns3和ns5a基因的E1202G、T1280I和S2197P位点进行细胞培养适应性突变,将突变后的片段分别克隆入pBluescriptIIKS(+)、pRSET-A载体,经测序正确后,分别连入含有HCV全长cDNA的质粒的H/FL相应位置,置换原未突变片段,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经PCR、酶切和DNA序列测定证实,预期位点发生突变,而其他序列未发生随机突变。结论:构建了含有不同组合细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA突变体,为HCV在细胞内复制机制的研究和可稳定复制、表达的HCV体外培养体系的研究奠定了基础。
- 孙梦宁薛小平尹文吕欣雷迎峰韦三华胡兴斌杨敬
- 关键词：重叠延伸PCR定点突变细胞培养
- 稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立被引量：4
- 2006年
- 目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em；分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm，再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3，1（-），构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm，经酶切鉴定及测序正确后，通过脂质体转染至P815细胞，持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT—PCR，IFA，Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm，建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体，稳定转染P815细胞，为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．
- 韦三华尹文雷迎峰胡兴斌杨敬吕欣孙梦宁徐志凯
- 关键词：丙型肝炎病毒表位真核表达转染
- 稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立被引量：1
- 2006年
- 目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段，BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3，1（-），转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3，经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT-PCR，IFA，Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．
- 雷迎峰尹文薛小平杨敬吕欣韦三华胡兴斌孙梦宁徐志凯
- 关键词：丙型肝炎病毒转染脂质体法细胞克隆
