国家自然科学基金(30371257)
- 作品数：10 被引量：47H指数：5
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- 弓形虫P30与佐剂CTA_2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析被引量：8
- 2005年
- 目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30CTX蛋白奠定基础。方法PCR扩增P30CTX复合基因,产物回收后与pMD18T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T P30CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1313bp的P30CTX基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA P30CTX。重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定。使用生物信息软件分析P30CTX复合基因,预测编码蛋白结构。结果重组质粒经PCR可得1313bp的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1313bp和3085bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP P30CTX基因,序列分析同源性为99.82%,P30CTX蛋白结构折叠无明显改变。结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30CTX的抗原性不会产生影响。
- 周怀瑜何深一丛华古钦民李瑛赵群力杨婷婷张加勤
- 关键词：刚地弓形虫P30酵母表达载体
- 弓形虫主要表面抗原p30单价及复合基因疫苗的构建被引量：12
- 2005年
- 目的 构建弓形虫单价基因疫苗 pcDNA3 1 p3 0及复合基因疫苗 pcDNA3 1 p3 0 ROP2 ,并比较两种疫苗对小鼠的免疫保护性。 方法 用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增编码弓形虫主要表面抗原 p3 0和弓形虫棒状体蛋白 2 (ROP2 )的基因片段 ,经T A克隆 ,将p3 0单价基因及 p3 0 ROP2复合基因片段分别插入真核细胞表达载体pcDNA3 1,构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1 p3 0及pcDNA3 1 p3 0 ROP2。分别免疫BALB/c小鼠 ,设磷酸缓冲盐溶液 (PBS)组、pcDNA3 1空质粒组为对照 ;酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测血清特异性IgG抗体 ;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。 结果 获得 pcDNA3 1 p3 0、pcDNA3 1 p3 0 ROP2重组表达质粒 ,用 pcDNA3 1 p3 0 ROP2免疫的小鼠 ,其IgG抗体吸光度 (A490 =2 0 5 1± 0 3 3 7)高于用 pcDNA3 1 p3 0的吸光度 (A490 =1 892± 0 3 69) (P <0 0 5 )。攻击感染弓形虫后小鼠生存时间 ,用 pcDNA3 1 p3 0 ROP2免疫的小鼠 ,较用 pcDNA3 1 p3 0的明显延长 (P <0 0 1)。 结论 弓形虫不同生活阶段的抗原复合基因疫苗较单价基因疫苗具有更好的免疫保护性。
- 杨婷婷何深一蒋华古钦民丛华周怀瑜张加勤李瑛赵群力
- 关键词：PCDNA3弓形虫基因疫苗真核细胞表达载体
- 弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建被引量：5
- 2005年
- 目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。
- 蒋华何深一周怀瑜丛华古钦民李瑛赵群力
- 关键词：弓形虫P30克隆
- 刚地弓形虫入侵、诊断和免疫方面的研究进展被引量：2
- 2007年
- 刚地弓形虫是严重危害人类健康的寄生虫之一，有关刚地弓形虫的生物学特性及其与宿主相互作用的机制等方面的研究成果，为弓形虫病防治研究提供了新的思路和方法。该文就近几年有关弓形虫入侵、诊断和免疫方面的研究成果进行了综述。
- 张洁何深一
- 关键词：弓形虫入侵免疫
- 弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护性被引量：11
- 2006年
- 目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒。ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定免疫鼠脾脏NK细胞杀伤率;流式细胞仪测定T细胞亚群;用弓形虫速殖子腹腔攻击感染小鼠,观察小鼠的生存时间。结果SAG1-SAG2组小鼠IgG抗体、IFN-γ、IL-2及CD4+/CD8+细胞比例均高于SAG1组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合DNA疫苗组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗较SAG1单基因疫苗具有更好的免疫保护性。
- 孙怡何深一丛华杨婷婷周怀瑜古钦民李瑛赵群力
- 关键词：弓形虫复合基因DNA疫苗
- 毛遮纶丝病被引量：1
- 2008年
- 毛遮纶丝病是一种全新的奇怪的皮肤病。其主要症状是患者身上会长出毛发状的纤维状物质，感觉纤维会在皮肤下蠕动。目前该病的病因还不清楚，存在各种假设。迄今为止，还没有专门针对毛遮纶丝病的临床研究。该文主要综述了该病的起源、主要症状及存在的争议，希望引起更多国内外专家学者的关注。
- 崔玉玲何深一
- 关键词：寄生虫妄想症
- 弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定被引量：3
- 2005年
- 目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。
- 周怀瑜何深一古钦民丛华张加勤李瑛赵群力
- 关键词：刚地弓形虫P30ROP2毕赤酵母基因表达
- 弓形虫表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因在毕赤酵母中的分泌表达被引量：2
- 2005年
- 目的:探讨毕赤酵母能否高效表达具有生物学活性的弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B重组蛋白(P30-CTA2/B)。方法:将目的基因定向亚克隆入pGAPZαA表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-CTX;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌摇瓶表达,取上清液行SDS-PAGE和Westernblotting分析。结果:在毕赤酵母菌中分泌表达P30-CTA2/B重组蛋白,产量高达0.57g/L;SDS-PAGE显示其在49000处有一条明显表达蛋白条带,Westernblotting显示表达蛋白具有P30抗原特异性。结论:大量具有免疫活性的P30-CTA2/B重组蛋白在毕赤酵母中表达,为弓形虫亚单位复合疫苗的研制和大规模动物实验创造了条件。
- 周怀瑜何深一丛华古钦民李瑛赵群力张加勤杨婷婷
- 关键词：弓形虫病毕赤酵母
- 大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响被引量：1
- 2010年
- 目的研究大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响。方法构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-ROP2和pEASY-E1-LTB。BALB/c小鼠88只,随机均分为4组,分别用PBS(A组)、pcDNA3.1空质粒(B组)、pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒(C组),以及pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒和pEASY-E1-LTB质粒(D组)进行滴鼻免疫,每种质粒20μg/(只·次)。每组小鼠随机抽取15只,每周免疫1次,共4次,末次免疫后2周,测定其血清IgG和IgA抗体水平,气管和小肠黏膜冲洗液分泌型IgA(sIgA)水平,以及脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平;每组中余7只小鼠,每周免疫1次,共3次,末次免疫后4周,弓形虫速殖子腹腔接种感染(1×103/鼠),观察比较各组生存时间。结果成功构建pEASY-E1-LTB重组表达质粒。D组小鼠血清IgG(0.626±0.100)和IgA抗体水平(1.086±0.138),气管和小肠黏膜冲洗液sIgA水平(0.886±0.164),以及细胞因子IFN-γ[(2017±266)pg/ml]和IL-4水平[(203±31)pg/ml]均显著高于其他各组(均P<0.05)。感染弓形虫速殖子后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为3、4、6和10d,D组的生存时间长于其他各组(均P<0.05)。结论LTB能明显增强弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因的免疫效果。
- 赵红何深一李婷赵广会周怀瑜赵群力
- 关键词：复合基因疫苗不耐热肠毒素
- 弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察被引量：18
- 2005年
- 目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。
- 杨婷婷何深一张加勤周怀瑜丛华古钦民李瑛赵群力
- 关键词：弓形虫SAG1ROP2复合基因
