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猪肌生成抑制素在COS-7细胞中的表达及检测: 2005年; 本研究室构建的猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,转染到COS-7细胞中,使猪MSTN成熟蛋白编码序列全长358个氨基酸在COS-7细胞中进行表达,利用Trizol试剂提取转染细胞的总RNA,借助RT-PCR和SDS-PAGE电泳方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了猪MSTN在COS-7细胞中的表达,并应用Western-blotting方法证实了猪MSTN表达的特异性。; 吕文发逄大欣欧阳红生; 关键词：肌生成抑制素真核表达 COS-7细胞

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆被引量：1: 2003年; 将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段,F_1、F_2、F_3、R_6、R_5、R_4、F_4、F_5、F_6、R_3、R_2和R_1,采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F_1长38bp,R_1长36bp,其他片段均40bp长,F_1和R_1片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段。该片段与pMDI8-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。; 吕文发赵静欧阳红生; 关键词：基因合成基因克隆负调控因子

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化: 2004年; 猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA去除信号肽后对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1 2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27 9%,表达的MSTN分子量为41451 3D.因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,则用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92 5%.该试验为获得较好的猪肌生成抑制素基因抗原、制备抗体打下了良好的基础。; 张锐孙美榕欧阳红生张玉静

猪肌生成抑制素基因编码序列的分析被引量：8: 2000年; 通过PCR分段扩增出军牧 1号白猪的肌生成抑制素基因编码序列 112 8bp ,与国外猪种同一基因的cDNA序列进行比较 ,仅在 634bp处发生了由T替换C的变化 ,但对应的氨基酸没有变化。; 孙博兴侯万文欧阳红生李慎涛郭淑艳; 关键词：PCR DNA序列分析

诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建及鉴定被引量：2: 2009年; 通过PCR方法分别从pGL3-Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA;利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGCFRT2NeoR上用XholⅠ和SalⅠ酶切得到FRT2NeoR盒子。将上述4个片段利用SOE-PCR及T4DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体pET28a(+)构建Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。用LipofectamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,G418筛选阳性细胞,PCR鉴定。结果表明,成功构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,并成功整合到猪成纤维细胞的基因组中,获得了诱导性表达Cre重组酶的转基因猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得诱导性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。; 陈立梅逄大欣李莉李占军杨春聂代邦欧阳红生; 关键词：CRE重组酶原核表达载体 SOE-PCR

猪肌生成抑制素组织分布研究被引量：8: 2004年; 利用经纯化、偶联后的猪肌生成抑制素包涵体获得的高效价猪肌生成抑制素 (MSTN)抗血清进行免疫组织化学实验 ,结果表明 :MSTN在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪细胞中呈现重度染色 ,说明MSTN在这些组织细胞中均有分布。而在肌肉、肾脏、子宫细胞中出现轻微染色 ,这说明MSTN在这些组织细胞中分布较弱 (2 0 0倍光镜 ) 。; 吕文发赵静欧阳红生梁冠生王恒; 关键词：畜牧学免疫组织化学

猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备被引量：11: 2003年; 用IPTG诱导pET 28α MSTN BL21工程菌产生猪肌生成抑制素下游包涵体,应用SDS-PAGE侧带法纯化包涵体蛋白,并用EDCI进行直接偶联,皮下多点注射试验用獭兔,连续免疫3次,每次间隔2周,其间用ELISA跟踪检测抗体效价。6周后,心脏采血,获得高效价的抗血清,血清滴度达1∶6400。; 吕文发赵静卢广林欧阳红生; 关键词：MSTN 骨骼肌偶联

真核基因在pET系统中表达出现的问题与拟解决的方案被引量：31: 2004年; pET表达系统是以噬菌体的T7为启动子 ,可以从各种基因 (包括原核、真核细胞 )生产大量的目的蛋白[1 ] ,然而一些真核基因在pET表达系统中的蛋白表达量却很少 ,有许多因素影响真核基因在该表达系统中的表达 ,如信号肽序列、毒性基因与质粒的稳定性、mRNA转录的二级结构和稀有密码子 ,以及实际操作过程中表达条件等均会影响真核基因在pET系统中的表达。该文旨在分析其主要原因 ,并提出拟解决的方案 ,以达到满意的高效表达。; 张锐孙美榕欧阳红生张玉静; 关键词：真核基因原核表达系统噬菌体启动子

血小板源性生长因子(PDGF-BB)促进山羊骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化被引量：4: 2008年; 将血小板源性生长因子(PDGF-BB)作用于骨髓间充质细胞,分别于5、7d后用抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体进行免疫组化分析,定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达,透射电镜观察细胞超微结构。免疫组化结果显示,PDGF-BB诱导组表达α-SMA的细胞数约为95%,而对照组表达α-SMA的细胞数约为5%。免疫组化图象分析结果显示,5、7d PDGF-BB诱导组抗α-SMA着色平均灰度值小于对照组。RT-PCR结果显示,PDGF-BB诱导组有α-SMA mRNA表达,而对照组则没有。透射电镜显示,骨髓间充质细胞经过诱导后细胞浆内出现肌丝样结构。结果表明,PDGF-BB可以促进骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化。; 张舒周杨关思宇梁霄玉欧阳红生; 关键词：骨髓间充质干细胞血小板源性生长因子平滑肌细胞

体外培养枫径猪胚胎成纤维细胞系方法的建立被引量：3: 2007年; 选取枫径猪胚胎,采用胶原酶消化培养法制备猪胚胎成纤维细胞,经数次传代培养及冷冻复苏试验表明胚胎成纤维细胞仍具有正常的传代能力。在体外培养至15代后成纤维细胞核型正常,符合体细胞克隆转基因的要求。用PCR方法建立了枫径猪胚胎成纤维细胞性别鉴定的反应体系,对其中6株细胞进行了性别鉴定。; 陈颖逄大欣车东升赵增明赖良学欧阳红生; 关键词：胚胎成纤维细胞体外培养

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