国家自然科学基金(36071832)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- β-防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1-6中的稳定表达被引量：1
- 2010年
- 目的克隆抗菌肽β防御素2(mBD2)基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1-6细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RT-PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap-PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),PCR、酶切和测序鉴定正确后,脂质体法转染Hepa1-6细胞,G418筛选,RT-PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果成功克隆含有信号肽的IgК-mBD2序列,并且构建pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,实现了mBD2分子在Hepa1-6细胞中稳定表达,RT-PCR从细胞总RNA中扩增得到202bp的IgК-mBD2基因,Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa1-6细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础。
- 梅寒芳金小宝朱家勇
- 关键词：防御素天然免疫肝癌
- β防御素2在恶性黑色素瘤B16细胞中的稳定表达及其生物学效应研究被引量：2
- 2011年
- 目的建立稳定表达防御素mBD2的恶性黑色素瘤细胞B16-mBD2,研究mBD2对B16细胞生物学特性的影响。方法在前期构建好mBD2真核表达质粒的基础上,脂质体法转染恶性黑色素瘤B16细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株B16-mBD2,RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达;MTT法鉴定其生长曲线;流式细胞仪分析细胞周期分布、凋亡情况及细胞膜表面分子CD80、CD86、MHCⅠ(H-2Kd)、MHCⅡ(I-Ad)的表达。结果成功构建稳定表达mBD2的B16细胞,RT-PCR和Western blot分别从mRNA及蛋白水平验证了mBD2分子表达;稳定表达mBD2的细胞B16-mBD2与转染空载体的B16-p细胞及野生型B16细胞相比,细胞增殖明显减慢,从48 h开始,各时间点细胞活力显著降低(P<0.05);B16-mBD2细胞处于S期的比例(36.03±0.97)%显著增高(P<0.05);凋亡率及细胞膜表面分子CD80、CD86、MHCⅠ(H-2Kd)、MHCⅡ(I-Ad)表达无明显差异(P>0.05)。结论 mBD2明显抑制恶性黑色素瘤B16细胞的增殖,其机制可能与诱导细胞周期S期阻滞有关;mBD2对细胞凋亡率及细胞膜表面免疫分子的表达无影响。
- 梅寒芳金小宝朱家勇
- 关键词：防御素天然免疫恶性黑色素瘤
