国家自然科学基金(30901735)
- 作品数：9 被引量：14H指数：2
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- 抗肿瘤疫苗MAGE1-MAGE3-HSP70蛋白特性及其纯化策略的研究
- 2011年
- 目的:对MAGE1-MAGE3-HSP70(M1-M3-HSP70)融合蛋白的理化性质及其纯化策略进行初步研究,为后期的临床前试验提供数据和依据。方法:以本实验室构建的菌种(BL21(DE3)pLysS-M1-M3-HSP70)为材料,采用常规细菌培养及诱导方法进行诱导表达,用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、免疫印迹(Western blotting)对目的蛋白进行分析,然后确定盐析条件,使用ButylSepharose HP疏水相互作用层析以及阴离子交换(Source 30Q填料)对目的蛋白的纯化进行分析。结果:M1-M3-HSP70蛋白在大肠杆菌中表达后,目的蛋白分为两部分,一部分为包涵体形式(44.9%),一部分为可溶表达(55.1%)。对其可溶部分进行研究发现,细菌裂解后,目的蛋白存在聚合和降解现象;确定了盐析条件、洗脱缓冲液以及稳定的PH值范围,基本确定了目的蛋白的纯化工艺。结论:明确了M1-M3-HSP70融合蛋白的基本性质,确定了目的蛋白的纯化方法,为基于融合蛋白的肿瘤疫苗的进一步研究提供了参考。
- 张秀敏史琪琪林慧王军伟李增山
- 关键词：融合蛋白降解
- 新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化被引量：1
- 2010年
- 目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。
- 张秀敏史琪琪李增山叶菁王军伟林慧曲萍胡沛臻隋延仿
- 关键词：基因融合癌症疫苗MAGE-N表位肽
- 胃肠道间质瘤KIT及PDGFRA基因突变的检测及分析被引量：5
- 2012年
- 目的:检测胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)KIT及PDGFRA基因的突变位点及类型,探讨其在GIST发病机制中的作用。方法:收集西京医院病理科2006年10月至2010年10月胃肠道间质瘤病例38例,男性20例(52.6%),女性18例(47.4%),从福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)组织中提取基因组DNA。通过PCR扩增目的片段后测序,检测38例样本的KIT和PDGFRA基因突变类型。结果:在38例样本中共检测出KIT基因突变34例,其中32例发生在外显子1 1,突变形式有点突变、插入突变与缺失突变;2例发生在外显子9,均为重复性突变。同时还检出PDGFRA基因突变1例,其余3例样本为野生型。结论:大多数GISTs中存在KIT基因的突变,PDGFRA基因突变可见于部分缺乏KIT突变的GIST中。
- 张秀敏林慧叶菁郭风袁媛隋延仿李增山
- 关键词：胃肠道间质瘤石蜡组织KITPDGFRA基因突变
- 吸毒患者中肠梗阻的发病观察
- 2011年
- 目的探讨吸毒患者中肠梗阻的发病情况，与毒品的关系及临床处理方法和效果。方法回顾性分析我院2007年1月～2011年1月戒毒中心收治的所有病人3865例，其中有57例肠梗阻患者。结果吸毒者中肠梗阻发病率为1．47％，其中动力性肠梗阻49例，机械性肠梗阻8例：其中有粘连压迫4例，肠坏死1例：腹外癌2例，肠系膜血管栓塞1例。前期均采取保守治疗严密观察。其中48例缓解，9例转入外科手术治疗。结论吸毒者中肠梗阻的发病率明显高于普通人群0．16％的发病率。这与毒品对人体的毒副作用及吸毒者的生活行为方式有关。
- 陈嫈
- 关键词：吸毒肠梗阻
- 细胞培养常见问题分析及防控措施被引量：2
- 2011年
- 细胞培养技术广泛用于科研、教学及临床研究实验，已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术，也是医学研究生必备的实验技能。本文就细胞培养过程中一些常见的问题及应对措施进行了阐述。
- 张秀敏郭风王净袁媛
- 关键词：细胞培养无菌操作污染
- 肿瘤相关基因MAGE-n的发现及研究进展被引量：1
- 2020年
- 黑色素瘤抗原-n(MAGE-n)基因是本实验室从肝癌细胞系中克隆得到的MAGE家族新成员,该基因与已报道的MAGE家族基因不同,但与MAGE-A家族基因具有同源性,与MAGE-6、MAGE-3同源性最高。我们分别检测了MAGE-n在不同组织、细胞中的表达和分布情况,结果发现:在正常肝组织、肝硬化组织及其它非肿瘤组织中未检测到MAGE-n的表达,而在肝细胞癌、胃癌等恶性肿瘤组织中表达率较高,且在其他不同肿瘤中的表达水平有差异。后续研究筛选鉴定出了HLA-A2限制性CTL表位,体内外实验均显示出良好的抗肝癌免疫效应。MAGE-n的这种表达模式和免疫特性与MAGE家族其他基因相同,提示其可作为肿瘤免疫治疗,尤其是肝癌免疫治疗的靶分子,为肝癌的免疫治疗研究提供新的策略。现就MAGE-n的研究进展作以下综述。
- 张秀敏李侠李增山
- 关键词：肿瘤免疫治疗
- 人胃肠道和胃肠外间质瘤microRNA表达谱的比较被引量：1
- 2011年
- 目的:比较消化道原发胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)与胃肠外间质瘤(extra-gastrointestinal stromaltumors,EGISTs)microRNA(miRNA)表达谱的差异,分析其与肿瘤原发部位、突变类型等因素间的关系。方法:收集西京医院病理科的8例石蜡样本(5例GISTs、3例EGISTs),利用安捷伦人miRNA表达谱芯片(芯片覆盖866个人miRNA)进行分析。同时通过PCR扩增后直接测序,明确8例样本的基因突变类型。结果:芯片数据经非监督层次聚类分析,显示8例样本分为3簇,具有相同突变类型的1例胃部GIST和1例EGIST构成第1簇,2例胃部GISTs构成第2簇,其余4例(2例小肠GISTs和2例EGISTs)构成第3簇。将5例GISTs按部位分成2组(胃部和肠道),3例EGISTs分别加入miRNA表型相似的组,2组比较后发现12个miRNA表达有显著差异;预测的靶基因多数参与KIT/PDGFRA的信号转导,其中有5个在肠道组显著下调,部分已有报道与肿瘤的演进相关。比较GISTs和EGISTs的表达谱,发现仅有3个miRNA的表达差异具有统计学意义。结论:GISTs和EGISTs的miRNA表型相似,均与肿瘤部位及突变类型关系密切,因此miRNA表型的分析可能有助于GISTs在分子水平上的分类。
- 林慧张秀敏李增山
- 关键词：胃肠道间质瘤胃肠外间质瘤石蜡组织
- 人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究被引量：4
- 2012年
- 目的探讨从人外周血中大量培养树突状细胞(DC)的方法,并在表型、形态、结构等方面进行鉴定。方法采用5步法从人外周血中大量培养DC:①Ficoll不连续密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC);②RPMI-1640培养基离心洗涤去除血小板;③利用DC前体细胞的短暂粘附性去除悬浮细胞及粘附性较强的细胞;④用重组人白介素4(rhIL-4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)自外周血单个核细胞诱导分离DC;⑤用重组人肿瘤坏死因子诱导产生成熟的DC。用荧光显微镜检测DC表面分子的表达,在扫描电镜下观察DC的形态。结果获得了具有典型特征的DC前体细胞,在GM-CSF和rhIL-4协同诱导9 d后,荧光显微镜下可见DC表面CD83、CD40、HLA-DR的表达。扫描电镜观察可见:DC细胞形态不规则,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起,有的长度可达胞体的2～3倍,长突起存在分叉及汇合现象。在长突起的基部存在大量短小的圆形或椭圆形突起。结论人外周血来源DC的5步培养法可获得较高数量的典型DC,且该法稳定、简便、经济,为DC的临床免疫治疗提供了实验依据。
- 张秀敏曲萍郭风袁媛王净王超王慧
- 关键词：外周血单核细胞树突状细胞
- 树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究被引量：1
- 2011年
- 目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL的能力及其抗肿瘤效应。方法:MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验。结果:用DC负载MAGE-n表位肽QLVF-GIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用。结论:DC负载抗原肽QLVF-GIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应。
- 张秀敏郭风林慧曲萍
- 关键词：树突状细胞疫苗MAGE-NHLA-A2
