山东省科技发展计划项目(031050104)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达
- 2006年
- 目的:构建多药耐药基因(MDR1)启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法:采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子,将其连接到双自杀基因CD-TK的上游,构建pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK真核表达载体,用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞,PCR鉴定CD、TK基因的整合,RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示,CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中,RT-PCR结果显示,K562/A02/CD-TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达,而K562/CD-TK细胞无特异性条带。结论:MDR1启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。
- 王向玲纪春岩马道新赵建强侯明余海青臧绍蕾
- 关键词：启动子自杀基因
- mdr1启动子驱动的CD-TK双自杀基因载体对耐药K562细胞的体外靶向杀伤作用被引量：2
- 2006年
- 目的构建多药耐药基因(mdr1)启动子控制的胸苷激酶-胞嘧啶脱氨酶(CD-TK)双自杀基因真核表达载体,研究其对耐药白血病细胞K562／A02的靶向杀伤作用。方法利用分子克隆技术构建pcDNA3-mdr1 P-CD-TK真核表达载体,脂质体介导法转染K562、K562／A02细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞株。用PCR、RT-PCR鉴定TK、CD基因的稳定转染与表达,加用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-FC)培养4 d,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建了mdr1启动子控制的CD-TK双自杀基因真核表达载体,脂质体成功转染细胞后,经C418筛选获得稳定转染细胞株。PCR结果显示,CD、TK基因均稳定存在于K562、K562／A02细胞中,RT-PCR结果显示K562／A02-CD-TK细胞有CD、TK基因特异性条带表达,而K562-CD-TK细胞无特异性条带。加入GCV、5-FC后,与K562-CD-TK细胞相比,K562／A02-CD-TK细胞存活率明显降低(在60μg／ml(GCV和600μg／ml 5-FC联合作用后两种细胞存活率分别为85．04％和41．13％)(P<0．05),凋亡率明显升高(同样浓度下分别为2．93％,10．27％)。结论mdr1启动子驱动的CD-TK双自杀基因系统可以靶向杀伤多药耐药的白血病细胞。
- 王向玲纪春岩马道新赵建强侯明余海青臧绍蕾
- 关键词：基因自杀基因K562细胞
- 联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究被引量：1
- 2006年
- 目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。
- 余海青纪春岩马道新臧绍蕾
- 关键词：基因基因K562/A02多药
