国家自然科学基金(31260451)
- 作品数：11 被引量：25H指数：3
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- 相关机构：云南农业大学红河学院文山学院更多>>
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- 利用病毒诱导的基因沉默技术沉默TSWV的NSm基因被引量：1
- 2021年
- 【目的】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)在全球范围内严重危害农业生产,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术主要用于植物内源基因的功能研究,而其沉默植物外源病毒基因用于病毒防控鲜有报道。本研究利用VIGS技术在辣椒中沉默植物外源病毒TSWV的NSm基因,为辣椒产业防控TSWV病害奠定技术基础。【方法】以辣椒(Capsicum annuum L.)为研究材料,首先构建辣椒PDS基因的沉默载体pTRV2-PDS以评估该沉默载体在辣椒中的有效性,再构建TSWV NSm基因的沉默载体pTRV2-NSm评估该沉默载体对TSWV NSm基因的沉默效果。【结果】构建的沉默载体pTRV2-PDS在辣椒中有效,沉默载体pTRV2-NSm可以高效沉默TSWV的NSm基因,NSm的表达量仅为对照组的4.6%,且表现出对TSWV的抗性。【结论】构建的沉默载体pTRV2-NSm可以沉默TSWV的NSm基因,并使辣椒对TSWV产生一定的抗性。
- 张萍萍桂敏李慧芳张美玲李永忠刘雅婷
- 关键词：番茄斑萎病毒烟草脆裂病毒
- 番茄斑萎病毒侵染辣椒后病毒积累量动态变化被引量：2
- 2023年
- 为探究番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)侵染感病辣椒品种‘萧新19’后病毒积累量变化规律,本研究将TSWV人工摩擦接种于‘萧新19’植株,通过症状学观察、血清学及半定量RT-PCR三者结合的方式监测接种后第1、7、14、21、28、35天(days post inoculation, dpi)的‘萧新19’新叶的发病情况。利用实时荧光定量PCR技术对6个时期样品的病毒积累量进行定量检测分析。症状学观察发现在14 dpi‘萧新19’才开始表现症状,随后病症逐渐明显,伴随有同心环纹、坏死斑点、褪绿等症状,随时间推移病症逐渐加重。血清学及半定量RT-PCR检测均表明TSWV接种成功。RT-qPCR病毒积累量的检测结果显示,在14 dpi‘萧新19’叶片病毒的积累量达到最高,在1~14 dpi里辣椒叶片病毒积累量呈上升趋势,14 dpi后病毒积累量呈下降趋势。研究表明只有当‘萧新19’新叶的TSWV量积累到一定水平时,寄主才会显症,这为下一步辣椒的早期诊断和防控提供了新思路。同时感病辣椒品种‘萧新19’的TSWV积累量整体呈现“先增后降”的变化规律,也为后续辣椒TSWV感病机制相关研究提供了理论基础。
- 许云玉贾志强高雪陈增敏李永忠刘雅婷
- 关键词：番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR辣椒
- 辣椒CaWRKY30转录因子的克隆、亚细胞定位及番茄斑萎病毒侵染下的表达分析被引量：4
- 2022年
- 为研究辣椒CaWRKY30转录因子与番茄斑萎病毒互作的响应机制,以辣椒湘研11为试验材料,通过RNA提取、RT-PCR、切胶纯化及克隆等试验获得CaWRKY30编码序列。生物信息学分析结果表明,CaWRKY30全长1122 bp,编码373个氨基酸,该基因编码的蛋白含有1个WRKY保守结构域和1个C_(2)H_(2)结构域,属于典型的Ⅱ(e)亚家族成员。系统发育分析表明,与马铃薯StWRKY22氨基酸序列的亲缘关系最近。本氏烟叶片亚细胞定位试验发现,CaWRKY30在本氏烟幼苗中定位于细胞核和细胞膜,并且导致细胞膜加厚。实时荧光定量PCR分析结果表明,观察番茄斑萎病毒机械摩擦接种辣椒后的病毒积累量,发现病毒积累量在接种1~14 d逐渐上升,在接种后14 d处于最大值,接种14 d后病毒积累量逐渐下降;同时,CaWRKY30受番茄斑萎病毒接种后诱导,在接种病毒1~14 d CaWRKY30表达量上调,14 d达到峰值,14 d以后表达量逐渐下降。综上,获得了CaWKRY30转录因子基因序列,该转录因子定位于细胞核和细胞膜,并初步阐述了辣椒CaWRKY30转录因子在番茄斑萎病毒胁迫下的表达趋势。
- 贾志强许云玉高雪陶宏征陈增敏刘雅婷李永忠
- 关键词：辣椒生物信息学番茄斑萎病毒
- 辣椒上TRV介导的番茄斑萎病毒N基因沉默体系构建及鉴定被引量：3
- 2021年
- 【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。
- 李慧芳桂敏张萍萍张美玲李永忠刘雅婷
- 关键词：番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR烟草脆裂病毒核衣壳蛋白基因
- TSWV侵染辣椒的胼胝质沉积及细胞病理学研究
- 2022年
- 【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)侵染寄主植物辣椒(Capsicum annuum)时辣椒的防御反应,揭示其病变规律。【方法】摩擦接种TSWV,于接种后1、3、7、14和21 d采集辣椒系统叶片,利用苯胺蓝染色法和透射电子显微镜技术观察胼胝质沉积及超微结构变化。【结果】TSWV接种于辣椒后,辣椒细胞内观察到TSWV病毒粒子,在辣椒系统叶片气孔、筛管和细胞壁上均观察到胼胝质沉积,同时细胞超微结构发生病变,叶绿体结构被破坏,出现变形和解体现象,严重时引发细胞死亡。【结论】TSWV侵染辣椒后,辣椒启动胼胝质沉积进行防御反应,以阻止病毒进一步入侵;但同时也会引起细胞发生病变,导致植物出现褪绿、畸形和坏死等现象。
- 张美玲赵肖梅许德万李永忠刘雅婷
- 关键词：番茄斑萎病毒辣椒超微结构变化
- 中国南部地区蜘蛛兰上朱顶红褪绿环斑病毒RNA L序列分析
- 2021年
- 朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus, HCRV)流行和扩张速度极快,严重危害多种蔬菜和花卉产业,造成严重的经济损失,已上升成为中国南部地区正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)优势种。对不同地区HCRV分离株进行克隆,研究其在不同地区快速扩张和进化的机制对农业发展具有重要意义。本研究对2013-2015年在云南、广东、广西、福建和海南等5个中国南部地区采集的疑似感染Orthotospovirus属病毒的蜘蛛兰样本,采用RT-PCR技术鉴定、分离,得到10份HCRV新分离株,对其L序列进行克隆、测序。结合现有分离株,利用DNAMAN 7.0和MEGA 7.0进行分子多样性、系统发育和重组分析。结果显示,本研究的10份HCRV L分离株,包括1个最早报道的HCRV HLS1-2 L分离株,可分为2个不同来源的类群。结合10份分离株采集地的环境信息,对比可看出其气候、温度、降水等差异很大,推测HCRV在中国南部地区的广泛分布与不同地区多态的气候类型有关,在它们的进化过程中,突变和重组发挥作用。RdRp是参与HCRV在细胞内的复制和转录的重要蛋白,对RdRp序列的分析,可为后续研究HCRV RdRp的遗传变异对HCRV侵染能力的影响提供理论基础,也为HCRV的防治提供思路。
- 李慧芳高君直贾志强桂敏刘雅婷李永忠
- 关键词：系统发育分析突变
- 侵染昆明园林植物的4个HCRV分离株核壳体蛋白氨基酸序列分析被引量：2
- 2021年
- 【目的】比较分析侵染昆明园林植物HCRV核壳体蛋白氨基酸序列,探究地理分布和寄主来源与病毒变异的相关性。【方法】2016年,在云南省昆明市园林景区采集疑似感染番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒样品,利用RT-PCR技术测定出葱莲(Zephyranthes candida)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和酢浆草(Oxalis corniculata)4份感染朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)的样品,通过克隆、测序获得4份样品的S RNA序列,利用ORF Finder获得核壳体蛋白(nucleocapsid protein,N)并进行序列分析。【结果】文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV新寄主;4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次报道的HLS1-2 N蛋白(登录号:AFX74694)一致性达到99.34%;系统进化树分析显示:4个HCRV分离物与GenBank公布的同样来自云南的株系聚为1支。【结论】病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。
- 王宇琪吴保为陶宏征贾志强高雪王景文刘雅婷
- 朱顶红褪绿环斑病毒在细角带蓟马中的增殖规律研究
- 2020年
- 【目的】朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)危害严重,细角带蓟马(Taeniothrips eucharii)是其主要的传播媒介。明确HCRV病毒粒子在细角带蓟马体内的增值规律,为HCRV防控提供理论依据。【方法】应用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR),结合HCRV N基因和细角带蓟马βactin基因特异性引物,选用SYBR Green方法对获毒后不同虫龄细角带蓟马体内的HCRV含量进行定量分析。【结果】所建立的实时荧光定量方法可以准确特异地对细角带蓟马中的HCRV进行相对定量,发现1龄若虫的HCRV核酸含量最低,1龄若虫、2龄若虫及蛹中的病毒含量没有统计学差异,成虫的HCRV核酸含量最高。【结论】细角带蓟马在获毒后,体内HCRV核酸含量随着细角带蓟马的发育而增加。
- 吴家琦徐烨李永忠刘雅婷
- 关键词：荧光定量PCR
- 云南省不同地区烟草上TSWV NSs氨基酸序列分析被引量：1
- 2021年
- 【目的】探究不同正番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)分离物中NSs与其地理来源和寄主二者之间的相关性,阐明云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs适应性进化情况。【方法】利用RT-PCR、克隆、转化和测序技术,从云南不同地区已经确定感染TSWV的8份烟草样品中获得NSs氨基酸序列。采用DNAMAN 8.0和MEGA 7.0软件,对云南不同地区8个烟草样品与GenBank公布的烟草、番茄和辣椒上31个TSWV NSs氨基酸序列进行比对分析。通过The Selecton Server软件,对云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs氨基酸序列进行选择压力分析。【结果】云南不同地区8个烟草样品与同样来自中国云南烟草、番茄和辣椒上TSWV NSs氨基酸序列在系统发育树中处于同一支,亲缘关系最近;与来自韩国的番茄和辣椒上TSWV NSs氨基酸序列位于同一大支,亲缘关系较近;而与来自欧洲保加利亚烟草上TSWV NSs氨基酸序列处于不同分支,亲缘关系最远。在云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs氨基酸序列中未检测到正选择位点。【结论】不同TSWV分离物中NSs与其地理来源有明显的相关性,但跟寄主的相关性不大。云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs稳定的保持其增强病毒症状、抑制沉默等功能。
- 王景文王偲博陶宏征高雪贾志强王宇琪李永忠刘雅婷
- 关键词：烟草TSWVNSS氨基酸序列地理来源
- 番茄斑萎病毒侵染辣椒苗期的差异基因表达分析被引量：1
- 2022年
- 为了研究番茄斑萎病毒与辣椒的互作机制,探究病毒侵染后mRNA表达谱,本研究选用‘萧新19’为试验材料,利用Illumina RNA-seq测序平台进行转录组测序,将所得高质量的序列(Clean reads)与CM334_Annuum.v.2.0参考基因组进行比对。结果显示,有74.09%~76.91%数据比对到唯一的基因组位点。采用FPKM法计算基因的表达量,并在此基础上以FDR≤0.05和|log_(2)FC|≥1为条件筛选出2组样本间差异表达基因。对差异基因进行Gene ontology(GO)和KEGG富集分析,通过排列前5的GO分析发现,主要分子功能有催化活性、结合等过程,差异表达基因显著富集到次生代谢物的生物合成、苯丙烷类生物合成、亚麻酸代谢等过程。从苯丙烷类合成途径和转录因子中挑选基因用RT-qPCR来验证转录组测序的真实性。通过研究发现,辣椒与番茄斑萎病毒互作是一个复杂的过程,它由多个交叉通路调节,包括苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、新陈代谢过程等,这为后期深入研究辣椒与番茄斑萎病毒互作机理奠定基础。
- 贾志强高雪陶宏征刘雅婷李永忠
- 关键词：辣椒番茄斑萎病毒转录组
