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屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定被引量：9: 2006年; 目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。; 刘志刚杨慧付颖媛高波朱健琦吉坤美; 关键词：屋尘螨变应原 P 复性纯化

猫过敏原白蛋白的克隆表达、纯化和免疫学特性鉴定被引量：1: 2007年; 目的克隆、表达猫过敏原白蛋白(Fel d 2),并分析其过敏原活性。方法提取猫肝脏总RNA,逆转录合成cDNA,采用适宜引物进行PCR扩增目的基因,随后将其克隆到原核表达载体PET24a(+),在大肠杆菌中进行表达,镍亲和柱层析法提纯重组蛋白,Western blot检测其过敏原活性。结果序列分析表明所克隆白蛋白的序列由1 752 bp组成,编码584个氨基酸,与Genebank上的基因序列(NM 001009961)同源性为99.9%。SDS-PAGE显示表达的重组白蛋白Mr65 000。免疫印迹表明重组白蛋白具有与猫过敏原过敏病人血清IgE结合活性。结论表达的重组白蛋白具有与猫过敏患者血清IgE结合活性。; 许卓谦刘志刚朱建琪; 关键词：克隆免疫学鉴定

食品过敏原指纹图谱快速检测研究(三)——花生总蛋白 2- DE 指纹图谱和蛋白点 MALDI- TOF/MS分析被引量：6: 2006年; 目的建立一种简捷、准确、快速检测食品过敏原的方法。分析花生总蛋白2-DE(2-dimensionelectrophoresis)指纹图谱与蛋白点MALDI-TOF/MS分析联用的可行性。方法新鲜生花生去皮搅碎后丙酮去脂,PBS抽提总蛋白,冻干得初提样品,试剂盒精提,双向电泳IEF选择11cm非线性胶条(pH=3-10)溶胀上样,平衡后转移胶条在电泳槽中进行第二向SDS-PAGE垂直电泳(10%),考染后扫描图像进行计算机分析处理,同时在胶上任意选择两个蛋白点切胶、脱色、消化后进行MALDI-TOF/MS分析。结果2-DE指纹谱图显示花生总蛋白的分布范围较窄,主要是一些中、小分子量的中性、弱酸和弱碱性蛋白,用PDQuest2-DAnalysis分析软件对此2-DE图谱分析可以发现其中共有178个特征性蛋白点。以花生总蛋白2-DE指纹图谱为基础,进一步对单个蛋白点进行MALDI-TOF/MS指纹图谱分析,结果显示每一个蛋白点都具有自己特征的分子量峰和图谱形状,无需进行肽片段混合物的分析、检索亦可完全区分不同的蛋白点,从而可以对食品过敏原进行更深入、更准确的指纹图谱检测。结论食品过敏原总蛋白2-DE指纹图谱与蛋白点MALDI-TOF/MS指纹图谱分析联用可以更好的进行食品过敏原指纹图谱快速检测研究。; 吴海强余晓刘志刚; 关键词：食品过敏原指纹图谱 2-DE

家蚕蚕蛹变应原的鉴定、分离与纯化被引量：19: 2006年; 目的鉴定、分离和纯化大造(Dazao)品系家蚕(Bombyxmori)的蚕蛹粗提液中的变应原蛋白质组分,为家蚕变应原的蛋白质组学和功能基因组学深入研究奠定基础。方法采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting,鉴定了家蚕蚕蛹粗浸液中变应原蛋白质分子,并通过阴离子交换和凝胶过滤层析分别对家蚕蚕蛹变应原蛋白质进行初步纯化。结果在家蚕蚕蛹粗浸液中含有表观分子量分别为80000及30000的蚕蛹变应原;从家蚕蛹全虫粗提液中初步分离到分子量为30000的蛹变应原蛋白组分。结论分离得到的家蚕蚕蛹变应原蛋白组分可用于系统研究家蚕过敏原蛋白分子的蛋白质组学和功能基因组学。; 张杰刘志刚林格叶湘锋刘瑞涛; 关键词：离子交换层析

荔枝果实中泛变应原profilin基因的克隆及序列分析被引量：10: 2006年; 目的克隆荔枝果实中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(profilin)同源基因。方法采用生物信息学方法对多个植物泛变应原基因进行序列同源性比对,根据序列保守区域设计并合成简并性引物,通过RT-PCR和3'-RACE技术克隆荔枝果实中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。结果获得了一个全长的新基因(689bp)。该基因开放阅读框为396个碱基,编码131个氨基酸残基,经分析该蛋白等电点为4.98,分子量约为14060。此序列已被GenBank收录,登陆号为DQ309464。序列分析结果显示所克隆到的基因与许多水果和花粉的泛变应原profilin基因有很高的同源性(与桦树和橡胶花粉泛变应原profilin的同源性分别为80%和84%,与桃子profilin的同源性为85%),因此认定其为泛变应原基因。结论从荔枝果实中成功地克隆出了一个泛变应原基因,为进一步的蛋白表达奠定了基础。; 张红云宋娟娟刘志刚康敏雄; 关键词：荔枝 PROFILIN 基因克隆

缢蛏泛变应原原肌球蛋白的克隆表达、纯化及其免疫学特性研究被引量：1: 2007年; 原肌球蛋白（tropomyosin）作为泛变应原广泛存在于无脊椎动物体内，本研究从缢蛏中克隆出一个原肌球蛋白基因。缢蛏（Sinonvacula constricta）购于深圳市水产品市场。9个缢蛏过敏病人的阳性血清来自深圳市人民医院和儿童医院（经Unit CAP 检测，2级以上）。缢蛏原肌球蛋白 cDNA片段转入表达载体（pET-28a），引物序列P5：5＇-GGACATATG-GAGGCCATCAGTTGGC-3；p3：5＇-CCGGAAT-TCTTAGCCAGTCAGTTKCGC-3＇。重组原肌球蛋白基因表达按常规方法进行。目标蛋白洗脱组分透析并保存。纯化缢蛏重组原肌球蛋白进行SDS-PAGE，电转到纤维素膜上，再经常规免疫学方法鉴定。重组原肌球蛋白分离后进行酶切，混合肽进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定。; 李荔李启沅刘志刚; 关键词：原肌球蛋白克隆表达免疫学特性缢蛏 MALDI-TOF-MS 纯化

缢蛏过敏原的分离、鉴定与纯化被引量：3: 2007年; 以磷酸盐缓冲液提取蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其抗原成分进行分析,选用缢蛏过敏患者的阳性血清进行免疫印迹,鉴定出主要与次要过敏原.用高压液相色谱(HPLC)纯化主要过敏原蛋白,鉴定其免疫活性,结果表明,缢蛏粗提液SDS-PAGE显示有18条蛋白条带,含量高的蛋白有6条,其分子量分别为110kD、55kD、42kD、38kD、35kD和28kD,其中以35kD处最为富集.经Western-Blotting鉴定,58kD蛋白为缢蛏的主要过敏原,38kD、28kD和12kD蛋白为缢蛏的次要过敏原.HPLC体积排阻纯化后得9个峰,以SDS-PAGE检测,58kD的蛋白位于第4峰,其中有一条明显的蛋白条带.将该蛋白条带用HPLC反相纯化,得到两个峰.经Western-Blotting鉴定,58kD的主要过敏原位于反相纯化的第2峰.; 李荔李启沅刘志刚余晓; 关键词：缢蛏聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹高压液相色谱

美洲大蠊主要变应原的纯化与免疫学鉴定被引量：7: 2005年; 为利用蛋白纯化技术获得较高纯度美洲大蠊天然主要变应原,以进一步提高临床诊断的特异性和免疫治疗疗效。美洲大蠊全虫粗浸液通过DE-52离子交换层析、HiprepSephacrylS-200凝胶过滤层析等分离步骤得到了纯度为90%的目的蛋白,回收率为26%,经WesternBlotting分析74kDa的蛋白质具有免疫原性,为变应原疫苗的纯化和标准化奠定了基础。; 胡川刘志刚林立丰阴伟雄李金生; 关键词：美洲大蠊变应原层析纯化美洲大蠊纯化技术免疫学凝胶过滤层析

食品过敏原的检测与分析被引量：18: 2006年; 食品过敏已成为食品安全的一个极为严重的问题。本文中对现用的及前景看好的食品过敏原检测分析方法,如免疫学检测、PCR分析等方法的精确度、灵敏度、适用范围、重现性、限制性问题作了较为系统的综述。; 吴海强刘志刚; 关键词：食品过敏原

猫过敏原Fel d1基因的克隆、表达及特性鉴定被引量：1: 2006年; 猫过敏原是引起过敏性疾病（如哮喘、过敏性鼻炎）的常见吸入性过敏原之一，Fel d1是猫的主要过敏原之一。为此，我们对Fel d1 Ⅰ链和Ⅱ链进行克隆，构建Fel d1 Ⅱ链＋ Ⅰ链pET表达载体，表达重组蛋白并分析其免疫学特性。; 许卓谦刘志刚; 关键词：吸入性过敏原过敏性疾病过敏性鼻炎免疫学特性

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