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快速荧光定量PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法建立与应用效果评价的研究被引量：12: 2009年; 目的:建立一种快速、特异、灵敏、定量检测副溶血性弧菌及其毒力基因的方法,用于副溶血弧菌性食物中毒的应急检测。方法:根据GenBank中副溶菌(AY-289609)全基因序列上不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血素基因(tdh)、耐热相关溶血素基因(trh)为靶序列,设计引物与Tagman探针并对模板DNA制备方法和PCR反应时间进行改进与优化以提高检测速度,采集食物中毒样本与国家标准方法进行现场平行比对。结果:本方法检测时间仅需30 min。检出限2×101cfu/ml,定量线性范围2×103cfu/ml^2×108cfu/ml,对77份患者粪便增菌前后平行检测结果显示该方法检出率明显高于国家标准方法并具有统计学意义(χ2=58.80,P<0.01;χ2=42.98,P<0.01)。与7种常见肠道细菌均无反应。对6个浓度的副溶血弧菌测定的批内标准差在0.10~0.56之间。结论:该方法可在30 min内完成粪便中副溶血性弧菌的tlh、tdh、trh的检测,具有灵敏度高、特异性好、结果稳定、抗杂菌与药物干扰能力强等优点。非常适合食物中毒的应急检测。; 王忠发顾松叶王虹玲; 关键词：副溶血性弧菌

实时荧光定量PCR模板DNA快速制备的方法建立与应用被引量：11: 2009年; 实时荧光定量PCR技术于1996年美国Appied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快速、可以有效解决常规PCR污染问题等优点，已广泛应用于突发公共卫生事件应急处置中病原体的检测。提高实时荧光定量PCR的检测速度，服务于突发公共卫生事件应急检测是当前备受关注的技术问题。实时荧光定量PCR由模板制备和PCR两部分组成，缩短模板制备时间就可提高实时荧光定量PCR的检测速度。; 王忠发; 关键词：实时荧光定量PCR技术突发公共卫生事件污染问题应急处置

一起食物中毒患者粪便与可疑食品中副溶血性弧菌血清分型与毒力基因检测分析被引量：5: 2013年; 目的进一步了解副溶血弧菌性食物中毒患者粪便与可疑食物中的副溶血弧菌血清型和毒力基因分布。方法细菌分离改用L棒推凃其余参照GB/T4789.7-2003方法,对鉴定为副溶血性弧菌菌株做血清分型和毒力基因(tdh和trh)检测。结果从4份粪便样品和2份从可疑食品中共检出副溶血弧菌28株可分15个血清型,来源于粪便样本的17株副溶血弧菌tdh阳性、trh阴性,来源于可疑食品中的11株副溶血弧菌tdh与trh均阴性。结论该次食物中毒是由一组携带tdh毒力基因多种血清型混合的副溶血弧菌污染引起。; 张少华沈飚王忠发; 关键词：食物中毒副溶血性弧菌血清分型

病原微生物DNA的超快速提取方法建立与应用被引量：1: 2009年; 目的:为明显提高基于实时荧光定量PCR的微生物检测速度,应用于突发公共卫生事件发生时传染性疾病的早期诊断。方法:在煮沸裂解法的基础上对提取剂与提取时间进行改进与优化,并与优质柱式核酸提取试剂盒法、煮沸裂解法进行提取时间与提取效果比对。结果:超快速法可在5 min内完成病原菌DNA提取,煮沸裂解法与柱式核酸提取试剂盒法分别需要30 min和50 min。3种提取方法对不同病原体的提取效果通过对扩增曲线形态、灵敏度、重复性与ct值4项指标的比较均呈现高度一致性,ct值误差均<±1.5S、cv值均<3.9%,3种方法的ct值数据经F与t检验比较差异均不显著。结论:超快速法对病原微生物DNA的提取效果良好.提取速度明显快于柱式核酸提取试验盒法及煮沸裂解法,与实时荧光PCR配套可明显缩短检测所用时间,多次用于突发公共卫生事件应急检测取得良好效果。; 王忠发; 关键词：病原微生物实时荧光PCR

副溶血弧菌的gyrB基因环介导的恒温扩增技术检测方法的研究被引量：4: 2009年; 目的建立一种适合基层实验室应用和开展的快速检测副溶血弧菌的DNA环介导的恒温扩增法(LAMP)。方法针对副溶血弧菌的gyrB基因序列设计了4条引物(2条内引物、2条外引物),并对扩增反应条件进行了优化。结果整个检测过程仅需1.5h,可通过肉眼目测或电泳检测判断结果;对3株种系背景明确的副溶血弧菌不同实验对照株、23株副溶血弧菌地方分离株和32株其他肠道菌进行了检测,具有很高的特异性;该方法的最低检测限为24cfu/ml,具有良好的敏感性;应用于61份贝类海产品的现场检测,阳性率为100%,与实时荧光定量PCR方法的检测结果相符,阳性率高于传统的培养鉴定方法。结论本方法具有快速、灵敏、特异、简便、经济等特点,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值。; 王虹玲朱水荣梅玲玲; 关键词：副溶血弧菌

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浙江省科技厅项目(2008c32035)