艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项(2012ZX10001-008)
- 作品数：9 被引量：13H指数：2
- 相关作者：何玉先孟佳子吴昊张娜陈方圆更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院首都医科大学附属北京佑安医院温州医科大学更多>>
- 发文基金：艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家自然科学基金全球变化研究国家重大科学研究计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- SARS冠状病毒S蛋白噬菌体抗原库的构建及筛选被引量：1
- 2013年
- 本研究旨在构建SARS冠状病毒S蛋白特异性噬菌体抗原库,并用于鉴定抗S蛋白单克隆抗体的抗原表位。首先采用PCR技术扩增出SARS冠状病毒S蛋白的全基因,以DNaseI将其随机酶切成50～500bp不同大小的DNA片段。然后将DNA片段平末端化并连接到经过改造的噬菌体表达载体pComb3XSS,经电转化大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体感染获得S蛋白的特异性噬菌体抗原库。利用两个抗S蛋白单克隆中和抗体(S-M1和S-M2)对S蛋白抗原库进行富集和筛选。结果表明,我们成功构建库容量为5.7×106的S蛋白噬菌体抗原库。通过对S-M1和S-M2的有效富集和筛选,分别得到14个和15个阳性克隆,序列分析初步揭示了抗体的抗原表位。因此,S蛋白噬菌体抗原库的构建为鉴定S蛋白的抗原表位提供了重要的技术平台,对研发SARS疫苗和诊断试剂具有重要的科学意义和应用价值。
- 吴瑞平孟佳子何玉先
- 关键词：SARS冠状病毒S蛋白抗原表位
- 利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体被引量：3
- 2013年
- 以细胞法从HIV-1CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体。将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2-NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性。四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920)。这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位。我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24μg/mL、0.89μg/mL和3.09μg/mL。其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69μg/mL和3.52μg/mL。提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体。因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台。
- 张娜满来孙坚萍孟佳子何玉先
- 关键词：HIV-1中和抗体包膜蛋白噬菌体抗体库
- 低氧通过上调Wnt5a促进人胚胎干细胞向生血内皮细胞分化被引量：3
- 2013年
- 胚胎的早期发育是在低氧条件下进行的,低氧环境在胚胎血管发生及造血发育中起着重要作用,低氧条件能促进胚胎干细胞在体外向内皮细胞和造血细胞的分化,但低氧条件对造血细胞产生的具体作用及相应机制尚不清楚.本研究利用人ES细胞向造血祖细胞定向分化体系,发现低氧环境可以促进CD31+TIE2+造血内皮祖细胞的产生,2天后造血内皮祖细胞开始表达终生造血基因.进一步研究发现,低氧能够上调Wnt5a的表达,干涉Wnt5a能够抑制低氧环境对生血内皮细胞分化的促进作用.在正常氧环境下加入Wnt5a产生促进生血内皮细胞分化的效应,该效应与低氧处理促进生血内皮细胞产生的作用相似.本研究首次证明了低氧通过上调Wnt5a的表达促进人ES细胞向生血内皮细胞的分化,为ES细胞向生血内皮细胞的分化及造血祖细胞分化的研究提供了新的线索.
- 刘婷吕红霞汤旭明陈方圆高扬王承艳邓宏魁
- 关键词：低氧人胚胎干细胞WNT5A
- 半胱氨酸天冬氨酸特异性酶-1诱导的Pyroptosis及其在感染性疾病中的作用被引量：2
- 2015年
- 半胱氨酸天冬氨酸特异性酶-1（Caspase-1）的激活可诱导细胞通过一种称为Pyroptosis的方式死亡。Pyroptosis是一种程序性细胞死亡方式，其形态学特征有别于细胞凋亡或坏死，主要表现为包膜破裂，胞内容物外流。在许多感染性疾病中，Caspase-1诱导产生的细胞因子和细胞死亡可促进机体清除病原体；但在一些病原体感染中，Caspase-1活化引起的炎症反应和细胞死亡可能和病原体的致病机制有关。此文就细胞Pyroptosis时的形态学特征、机制及其在感染性疾病中的作用进行综述。
- 宋静静李威张彤吴昊焦艳梅
- 关键词：PYROPTOSIS
- ASAP1和ARF1通过调节mTOR重激活调控自噬性溶酶体再生被引量：2
- 2014年
- 自噬是一种在进化上保守的溶酶体依赖的降解途径.在缺乏营养的条件下,细胞会产生自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,并会通过自噬来降解自身物质.之后溶酶体会从自噬溶酶体再生,这个进化上保守的过程称为自噬性溶酶体再生(ALR),该过程由长时程饥饿中mTOR重激活引起.我们课题组在之前的研究工作中筛选出ARF1的GAP蛋白ASAP1参与调解ALR.本文在之前工作的基础上,发现ARF1会在ALR过程中转位到自噬溶酶体上.敲低ASAP1或者过表达连有GFP标签的ARF1的GTP形式,会抑制mTOR的重激活以及ALR.因此,ARF1以及ASAP1是通过调节mTOR的重激活而调控ALR发生.
- 崔依同王冲孙大晓祝明莉俞立
- 呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立被引量：1
- 2015年
- 目的确定呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4～9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7～9 d收获病毒液;配方1（0.1%人血白蛋白）为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。
- 王欣怡李树香刘敬崔文禹徐静
- 关键词：呼吸道合胞病毒病毒滴度
- 基于HIV-1 pNL4-3构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆被引量：1
- 2014年
- 目的在感染性克隆pNL4-3骨架上构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆。方法通过融合PCR将CRF07_BC pXJDC13的V3环与pNL4-3的env骨架进行融合并克隆至pNL4-3上。经过鉴定后将阳性V3嵌合克隆pNL4-3/XJDC13V3转染到293T细胞进行病毒包装并检测病毒的感染性。V3嵌合病毒的细胞嗜性分别用Ghost细胞系和MT-2细胞进行测定。结果利用融合PCR克隆方法在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3的嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC13V3。该嵌合病毒利用的辅助受体为CCR5,不能利用CXCR4,也不能在MT-2细胞上诱发合胞体。结论在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC13V3。该嵌合分子克隆为进一步研究CRF07_BC嗜性转变中V3关键位点提供了有利工具。
- 张磊王彦马丽英王海宁邵一鸣
- 关键词：人类免疫缺陷病毒V3嵌合病毒
- 系统疫苗学面临的挑战及其在HIV疫苗研发中的应用
- 2012年
- 免疫系统是一种由专职细胞和器官组成的复杂网络，参与免疫应答。在免疫应答时，细胞以一种复杂而又动态的方式互相交流、迁移、分化和死亡。在同一时间里，细胞或组织内数百万的功能分子（如基因、RNA分子、蛋白质和代谢产物）形成一个复杂的通路网络，密切协调以产生生物效应（如产生抗体、细胞分化、干扰素仪释放，激活内质网应激通路等）。采用传统方法单独研究系统每个成分，得到的可能是免疫系统的一种狭隘和孤立的知识。而系统疫苗学利用高通量技术可获得成千上万的RNA分子、蛋白质和代谢产物的整体观，以了解驱动免疫应答的生物网络的整体结构。
- 张宏伟张美吴昊
- 关键词：免疫系统疫苗研发HIVRNA分子细胞分化复杂网络
- HIV-1CRF07-BC gp41 HR2高突变区氨基酸结构和功能分析
- 2015年
- HIV-1包膜蛋白ENV介导病毒进入靶细胞,这个过程可以作为设计抗艾滋病药物的一个重要靶点,进入抑制剂能够抑制HIV进入靶细胞,从而在感染的最初环节抑制病毒的传播.为了更好地筛选针对中国株CRF07-BC的进入抑制剂,建立了细胞-细胞融合系统.通过比较CRF07-BC gp41和B亚型gp41的序列同源性和融合能力,gp41 HR2存在着一个7个氨基酸的高突变区.通过结构生物学对gp41 HR2高突变区进行分析发现,高突变区内氨基酸可以在功能上互补,保持了gp41的融合能力.这种功能互补性的研究可以为HIV gp41进化提供理论参考,为HIV-1进入抑制剂的设计提供更准确的靶点.
- 杜建森马婧刘方刘新奇
- 关键词：HIV-1GP41
