“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09506-001)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
- 相关作者：王颖吴标王海鹰宁正祥康可人更多>>
- 相关机构：华南理工大学上海交通大学第二军医大学更多>>
- 发文基金：“重大新药创制”科技重大专项国家高技术研究发展计划上海市教育委员会重点学科基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重链抗体的结构特点及其应用前景分析被引量：5
- 2013年
- 重链抗体(heavy chain antibody,HcAb)是存在于骆驼和鲨鱼类动物体内,轻链天然缺失,只有重链组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链,但是依然保留结合抗原的能力。通过基因工程的改造获得仅有可变区,但保留结合能力的新型工程抗体——单域抗体(single-domain antibody),也被称为纳米抗体(nanobody),具有相对分子质量小、稳定性高、易表达等优点;同时,克服了人源抗体改造后亲和力降低、易聚集等缺点,成为抗体药物研究领域的新型抗体分子。
- 蔡家麟夏立亮潘欣王颖
- 关键词：抗体药物
- 胞内抗体研究进展及临床应用前景
- 2012年
- 胞内抗体(intracellular antibody,intrabody)是一类在细胞内表达、特异性地靶向胞内抗原以期实现对相应功能的调节甚至阻断的新型基因工程抗体。最常见的胞内抗体形式为单链抗体(ScFv)。通过相应定位信号肽序列,胞内抗体能定位于胞浆、胞核、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜和过氧化酶体等各种细胞器,以实现对靶标抗原的功能性调控。其应用也由早先的干扰病毒复制和抑制肿瘤生长,逐渐拓展至治疗中枢神经系统退行性疾病、自身免疫病以及抑制免疫排斥等方面。本文对胞内抗体的作用机制、筛选策略、优缺点、应用及跨膜抗体作一综述。
- 吴标赵国屏王颖
- 关键词：胞内抗体单链抗体
- D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用被引量：3
- 2012年
- D-二聚体（D．dimer，D．D）是纤维蛋白单体经活化因子XIII作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能。与纤维蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）和弥漫性血管内凝血（DIC）等，均可导致体内D—D水平升高。近年来D．D的临床应用范围越来越广，除了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病。
- 康可人吴培钿卢艳华张健唐时幸王继华
- 关键词：D-二聚体快速定量检测免疫荧光抗体制备单克隆弥漫性血管内凝血
- 应用于侧向免疫层析方法学的高特异性抗吗啡单克隆抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 目的:制备高特异性抗吗啡(morphine,MOP)单克隆抗体(mAb),用于建立快速检测MOP的侧向免疫层析方法。方法:用吗啡BSA偶联蛋白(MOP-BSA)免疫纯系Balb/c小鼠并测定免疫效价后,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合制备杂交瘤,通过间接ELISA及竞争ELISA法,在筛选过程中即采用自建参考品进行灵敏度和药物交叉反应评价检测,获得能稳定分泌抗MOP的单克隆杂交瘤细胞株。制备腹水并纯化获得特异性抗MOP单克隆抗体(mAb),对抗体的效价、特异性、纯度、亚类进行鉴定分析后将其应用于侧向免疫层析方法检测尿液样本中的MOP。结果:成功获得1株稳定分泌抗体的阳性细胞株,用建立的侧向免疫层析方法检测临床样品达到国内、国际市场要求的灵敏度、特异性要求。结论:成功筛选出一株稳定分泌抗MOP抗体的杂交瘤细胞株,该细胞株分泌的抗体应用于侧向免疫层析检测方法中,能快速、特异、灵敏地检测出临床样品中的MOP,为MOP快速诊断试剂的研制提供了关键材料。
- 康可人黄绮玲谭仙桂李悦琳唐时幸王继华
- 关键词：吗啡单克隆抗体POCT免疫层析参考品
- 羊驼非免疫重链单域抗体库的构建和鉴定被引量：6
- 2011年
- 本研究旨在通过构建羊驼非免疫重链单域抗体库,完成抗体库多样性的鉴定,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。我们从未经免疫的羊驼外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),抽提RNA后,用RT-PCR方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段;并采用两步连接方法将重链抗体可变区片段与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠杆菌TG1后获得VHH抗体基因库;并采用稀释计数法测定抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体库多样性。结果显示,我们所构建的羊驼非免疫重链单域抗体库的库容量为1.5×109,随机克隆测序验证多样性良好,独立克隆所占比例为80%,并显示出和人源抗体较高的同源性。上述结果表明,我们已经成功构建获得大容量的羊驼非免疫重链单域抗体库,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。
- 吴标王树军夏立亮季萍葛海良赵国屏王颖
- 关键词：噬菌体展示羊驼
- 人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定被引量：2
- 2013年
- 本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。
- 李振东谷华玮王海鹰陈淑仪宁正祥王菊芳
- 关键词：人甲胎蛋白蛋白质印迹法
- 人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定被引量：1
- 2014年
- 为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。
- 毛爽陈少沛颜晟王海鹰宁正祥李杉王菊芳
- 关键词：蛋白印迹法
- 羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定
- 2012年
- 本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础。用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期。结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础。
- 夏立亮吴标程亚庭蔡家麟王颖赵国屏
- 关键词：H5N1禽流感病毒重链可变区包涵体复性
- 幽门螺杆菌单克隆抗体的制备及其检测应用被引量：2
- 2015年
- 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种定居于人胃部及十二指肠的微需氧革兰氏阴性菌,其长期感染导致胃炎、胃及十二指肠溃疡与胃癌。幽门螺杆菌感染主要始于儿童期,其自发性清除非常少见,及早通过检测发现并加以抗生素治疗可有效降低成人感染率。本文通过体外培养Hp标准菌株ATCC43504,将其裂解液作为抗原免疫Balb/c小鼠,通过常规技术路线制备杂交瘤细胞。经间接ELISA法筛选和多次有限稀释法亚克隆得到21株稳定分泌抗Hp抗原的杂交瘤细胞株,制备腹水并用辛酸硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体。将得到的单克隆抗体在胶体金免疫层析平台上进行配对和样品检测,获得多组灵敏度和特异性相对较高的单克隆抗体组合,其中以2-18E1作为包被抗体,2-9H5或2-17E9作为标记抗体检测细菌培养裂解物的最低限为25 ng/m L,为Hp抗原检测试剂的研发提供了基础。
- 马健倪超王海鹰宁正祥
- 关键词：幽门螺杆菌抗原单克隆抗体胶体金免疫层析
