“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09506-005)
- 作品数：4 被引量：6H指数：1
- 相关作者：代云见张勇侠王明蓉何勇智丛聪更多>>
- 相关机构：成都生物制品研究所有限责任公司中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所杜克大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 抗IgE单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究被引量：5
- 2012年
- 目的:以抗IgE单链抗体(anti-IgE scFv)为研究对象,以大肠杆菌周质高效表达可溶性单链抗体为目标,研究不同宿主细胞、培养基及培养条件对可溶性单链抗体表达产量的影响。方法:构建Rosetta(DE3)、BL21(DE3)和SoluBL21(DE3)三种大肠杆菌工程菌,研究不同碳源、氮源、培养基配方和培养条件对可溶性抗IgE单链抗体产量的影响。结果:携带抗IgE单链抗体基因的pET-IgE26质粒在新型宿主SoluBL21(DE3)中的表达产量明显优于传统的Rosetta(DE3)和BL21(DE3)宿主菌。经碳氮源筛选、培养基和培养条件的优化,确定SoluBL21(DE3)工程菌高效表达可溶性重组抗体的最佳培养基为:以M9培养基为基础,添加0.5%葡萄糖、0.6%酪蛋白胨和0.02%微量元素。最佳的培养条件为:以LB为种子培养基,37℃过夜培养至OD600为3.0左右,以5%接种量接种于最佳发酵培养基中;接种后细胞生长条件:37℃,260r/min,培养3.5h;细胞诱导培养条件:当OD600为1.5～1.8时,降温至25℃,添加0.1mmol/L IPTG,220r/min继续培养16h。经抗原ELISA检测,抗IgE单链抗体的可溶性表达量比原始对照组提高了5倍。结论:通过对宿主细胞类型的筛选、培养基及培养条件的优化,可以显著提高重组单链抗体在大肠杆菌周质空间内的表达产量。该研究结果不仅为规模化制备抗IgE单链抗体提供了技术支持,同时为大肠杆菌生产重组小分子抗体提供了有价值的参考。
- 刘启刚代云见张勇侠王保成王明蓉
- 关键词：大肠杆菌表达条件优化
- 全人源抗体基因库的构建及抗表皮生长因子受体单链抗体的筛选
- 2016年
- 目的从肿瘤患者外周血中构建全人源单链可变区抗体基因库，并采用真核核糖体展示技术高效筛选全人源抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单链抗体。方法采用PCR技术从52例晚期肿瘤患者外周血中构建大容量的全人源抗体基因库。针对EGFR抗原靶标，应用真核核糖体展示技术对该基因库进行高效富集筛选。通过大肠埃希菌表达体系对回收的基因库进行克隆、表达，并鉴定抗体活性。结果构建的全人源抗体基因库库容估算为4．3×1013。分子。对该基因库进行3轮富集筛选后，获得EGFR富集的单链抗体基因库。对回收基因库进行克隆、表达，并随机鉴定了49个克隆，获得结合力为10-8～10-7mol／L的2株全人源抗EGFR单链抗体。结论利用肿瘤患者外周血，结合核糖体展示技术可以较快获得具有医用价值的全人源单链抗体。
- 余馨何勇智丛聪李坤代云见张勇侠何静王明蓉何明跃
- 关键词：基因文库单链抗体核糖体展示技术外周血
- Anti-IgE单链抗体纯化工艺研究及活性鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的:建立anti-IgE单链抗体纯化工艺并对其活性进行鉴定。方法:根据protein L亲和层析填料和Ni亲和层析填料的特点分析,经初筛后选用protein L填料作为第一步初纯化填料,Ni亲和层析填料作为第二步精细纯化填料。通过对这两种纯化方式的上样条件和洗脱条件进行研究,建立了anti-IgE单链抗体的纯化工艺。结果:protein L亲和层析的初纯化工艺:最佳杂质洗涤pH=3.5,最佳目标蛋白洗脱pH=2.0,并且pH=2.0洗脱的目标蛋白收集在第二步Ni亲和层析的上样缓冲液中,可直接进行第二步Ni亲和层析纯化。所建立的Ni亲和层析精细纯化工艺:最佳杂质洗涤为50mmol/L咪唑,最佳目标蛋白洗脱为500mmol/L咪唑。经两步亲和纯化,目标产物在SDS-PAGE上纯度为99.0%,CE-SDS上纯度为99.5%,两步总收率为80.0%。纯化后的蛋白经竞争ELISA和Biacore检测,证实该产品特异性识别IgE靶标,与IgE靶标的亲和力达到8.59e^(-9)M,并且竞争Biacore结果显示该抗体对IgE有良好的中和活性,其抑制IgE的EC50值为70n M。结论:建立了一种高效、简洁的大肠杆菌表达的anti-IgE单链抗体纯化工艺,为其进一步规模放大工艺的建立奠定了基础。同时证明了该新型小分子anti-IgE抗体对靶标具有良好的特异性、亲和力以及中和活性,并展示出其在医用中的应用价值。所建立的小分子抗体纯化工艺技术对其他小分子单链抗体的纯化具有参考价值。
- 代云见张勇侠何勇智丛聪张涛王明蓉
- 关键词：哮喘
- 抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证
- 2015年
- 目的优化抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体体外生物学活性的检测方法,并进行验证。方法对TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法中的结晶紫染色液浓度、细胞浓度、放线菌素D(Act D)浓度及TNF-α杀伤浓度进行优化,并对该方法的精密度及专属性进行验证。绘制质量控制图,对抗TNF-α单克隆抗体样品进行20次重复检测。结果结晶紫染色液、细胞浓度、Act D和TNF-α的最适浓度分别为0.2%、1.5×105个/ml,1 ng/ml和0.8μg/ml。同一人员于不同日6次重复测定参考品的半数有效浓度(ED50)均值为(44.18±6.858)ng/ml,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为15.522%;不同日由3位不同人员重复测定参考品的ED50均值为(41.19±3.05)ng/ml,RSD值为7.40%;在TNF-α浓度一定的情况下,随着抗TNF-α单克隆抗体和阳性对照Humira浓度的降低,细胞的存活率随之降低,其他抗体无此现象。抗TNF-α单克隆抗体样品的20次测定结果均成立。结论成功优化了抗TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的条件,该方法具有良好的精密度及专属性。
- 潘勇兵张雅婷张银川宋桂芝桂芳闭兰
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体生物学活性
