国家自然科学基金(30370810)
- 作品数：17 被引量：21H指数：3
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- 抗肝癌hdsFv融合RC-RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定
- 2006年
- 目的制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析法纯化并复性,应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞,并且能够保持较强的稳定性。结论我们抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素的成功制备,为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。
- 付勇苏雪梅刘彦仿杨守京赵君邹赛英
- 关键词：肝细胞癌免疫毒素
- 来源于中国青蛙的一种核糖核酸酶新基因的克隆和序列分析被引量：2
- 2010年
- 张桂红付勇刘彦仿
- 关键词：核糖核酸酶
- 抗肝癌hdsFv融合hEDN重组免疫毒素对体外培养的人肝癌细胞的杀伤作用
- 2005年
- 目的:探讨重组免疫毒素hdsFv-hEDN在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,观察其体外杀伤作用。方法:利用IPTG诱导hdsFv-hEDN免疫毒素在大肠杆菌中的表达。诱导转化菌经超声碎菌、离心、N i-NTA Agarose亲合层析等步骤纯化,并通过SDS-PAGE和W estern-b lot进行分析及检测。采用MTT比色法观察其对人肝癌细胞的杀伤作用。结果:IPTG诱导后,hdsFv-hEDN在大肠杆菌中获得了可溶性表达,表达量为8%。表达产物纯化后,纯度达到基本均一。MTT结果表明,其对人肝癌细胞具有一定的杀伤作用。结论:本研究实现了hdsFv-hEDN重组免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化,获得了具有一定杀伤作用的抗肝癌重组免疫毒素。
- 付勇苏雪梅刘彦仿杨守京赵君李锴男邹赛英
- 关键词：免疫毒素单链抗体
- 人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建
- 2004年
- 目的克隆正常人T细胞CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,将其与二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的基因克隆入真核表达载体,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定基础,并探讨其对肝癌的杀伤活性。方法应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3,在5'端及3'端分别引入相应酶切位点;用RT-PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3ζ的胞内区、跨膜区基因,然后将其克隆于scFv的下游,并在5'端及3'端引入相应的酶切位点。结果二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为735bp,与已知的序列相符;CD3ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为294bp,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。结论完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3-scFv-CD3ζ的构建,为制备肝癌靶向性嵌合锚定T细胞奠定了实验基础。
- 王健李锴男孙妍琳刘彦仿付勇刁建升屈晓杰
- 关键词：单链抗体共刺激信号
- 抗肝癌hdsFv-hEDN重组免疫毒素的表达及生物学活性被引量：1
- 2006年
- 目的制备对人肝癌细胞具有特异性杀伤活性的抗肝癌重组免疫毒素。方法利用大肠杆菌系统表达抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素。表达产物经NiNTA亲和层析纯化后,进行特异性杀伤活性检测。结果抗肝癌hdsFvhEDN重组免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清中,并获得有效纯化。ELISA法检测证实其具有与相应抗原特异性结合的活性。细胞毒试验表明对肝癌细胞具有杀伤作用,而对正常肝细胞无损伤。结论已成功地制备了具有特异性结合和杀伤活性的抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素,为其进一步应用奠定基础。
- 付勇苏雪梅刘彦仿杨守京赵君邹赛英
- 关键词：肝癌免疫毒素生物学活性重组免疫毒素
- 牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化
- 2004年
- 目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。
- 付勇刘彦仿杨守京赵君李锴男
- 关键词：核糖核酸酶融合蛋白纯化
- 肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD_(3ζ)的构建与表达
- 2004年
- 目的 :构建抗肝癌单链抗体融合CD3 ζ真核表达载体。 方法 :应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3 ,在 5′端及 3′端分别引入相应酶切位点 ;用RT PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3 ζ的胞内区、跨膜区基因 ,然后将其克隆于scFv的下游 ,并在5′端及 3′端引入相应的酶切位点。以脂质体转染法将pcDNA3 scFv CD3 ζ转入T细胞 ,采用免疫细胞化学的方法 ,利用抗CD3 ζ的单克隆抗体检测转染前后T细胞中CD3 ζ的表达。 结果 :二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为 73 5bp ,与已知的序列相符 ;CD3 ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为 2 94bp ,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。转染前后T细胞中CD3 ζ染色强度显著增强。 结论 :完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3 ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3 scFv CD3 ζ的构建 。
- 李锴男刘彦仿孙妍琳付勇赵君高娟杨守京
- 关键词：T淋巴细胞
- 牛蛙核糖核酸酶基因原核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2004年
- 目的 :克隆牛蛙核糖核酸酶 (RC RNase)基因 ,构建重组原核表达载体 ,利用大肠杆菌系统表达RC RNase蛋白。 方法 :采用RT PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆RC RNase基因 ,并进行序列测定 ;将RC RNase基因插入到 6×His表达载体 pRSET A中 ,构建成表达质粒pRSET RC RNase ,用异丙基巯基半乳糖 (IPTG)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中诱导表达 ,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。 结果 :扩增出一条约 380bp的基因片段 ,双酶切鉴定和序列测定的数据与预期结果一致。经IPTG诱导 ,融合蛋白 (His) 6 RC RNase在大肠杆菌中得到成功表达 ,SDS PAGE上出现相对分子质量约为 16 0 0 0的一条新生蛋白带 ,经蛋白印迹验证为表达蛋白。薄层扫描显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 12 .5 % ,主要以包涵体形式存在。 结论 :正确克隆出RC RNase基因 ,并在大肠杆菌中得到成功诱导表达 ,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了基础。
- 付勇刘彦仿苏勤赵君张静梅
- 关键词：牛蛙核糖核酸酶大肠杆菌克隆免疫印迹法生物学特性
- 牛蛙核糖核酸酶对体外培养的人肝癌细胞的杀伤作用
- 2006年
- 目的:利用大肠杆菌系统表达牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase),观察其对人肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:构建PET32-RC-RNase重组原核表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)p lyS中并利用IPTG诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后,表达产物在变性条件下经N i-NTA-agarose亲合层析法纯化及复性,细胞毒试验检测其对体外培养的人肝癌细胞的杀伤活性。结果:经IPTG诱导后,大肠杆菌中表达的RC-RNase融合蛋白相对分子量(M r)约为31 KD,与预期大小基本相一致,主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后,获得纯度达到95%以上且对体外培养的人肝癌细胞具有明确杀伤活性的RC-RNase融合蛋白。结论:在大肠杆菌中表达的RC-RNase融合蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的杀伤作用。
- 付勇苏雪梅刘彦仿张桂红杨守京邹赛英
- 关键词：肝细胞癌核糖核酸酶融合蛋白
- 抗肝癌单链抗体免疫脂质体的制备及其体外抑瘤实验被引量：6
- 2006年
- 目的:比较抗肝癌单链抗体免疫脂质体(hdsFv25-lip.PE38,简称免疫脂质体PE38)、抗肝癌单链抗体免疫毒素(hdsFv-PE38,简称免疫毒素PE38)和载PE38脂质体(lip.PE38,简称脂质体PE38)对体外培养的肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用。方法:将磷脂(PC)、胆固醇(CHOL)和胆固醇琥珀酰酯(CHS)按一定比例溶于氯仿。除去氯仿后形成干膜,加入PE38蛋白溶液,超声、过滤及过Sephadex G-50柱子。测包峰率后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]、碳二亚胺盐酸盐(EDC)和氮羟基琥珀酰亚胺碘酸钠(SSNHS)在2-(n-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液中反应30m in,再加单链抗体(hdscFv),4℃过夜。用单四唑(MTT)法检测所制备的免疫脂质体、免疫毒素和脂质体对肝癌细胞的杀伤作用。结果:通过MTT法显示:免疫脂质体对肝癌细胞的杀伤效果最好,免疫毒素次之,脂质体最差,其半抑制浓度(IC50)值分别为0.59μg/m l、6.04μg/m l和92.07μg/m l。结论:载PE38免疫脂质体有望成为良好的新型抗肝癌药物。
- 张桂红刘彦仿付勇胡海洋陈大为杨守京赵君
- 关键词：免疫脂质体脂质体比色法
