国家科技支撑计划(2006BAD06A18-3)
- 作品数：8 被引量：28H指数：4
- 相关作者：徐志文郭万柱王小玉王印朱玲更多>>
- 相关机构：四川农业大学四川出入境检验检疫局金陵科技学院更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划长江学者和创新团队发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建被引量：6
- 2009年
- 根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。
- 王印郭万柱王新徐志文朱玲王小玉
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF2基因伪狂犬病毒重组病毒
- 高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立被引量：4
- 2009年
- 根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株。以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×10^9-3.15×10^0copies/μL具有良好的线性关系,相关系数（r^2）为0.998;最低检测限为3.15copies/μL。对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%。表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。
- 郭杨陈世界林华郭万柱徐志文颜其贵
- 关键词：高致病性PRRSVPOWERSYBR
- 猪伪狂犬病病毒蛋白激酶基因的克隆及其部分生物信息学分析
- 2010年
- 采用PCR方法扩增出12株伪狂犬病病毒（PRV）的蛋白激酶（Protein Kinase,PK）基因全序列,并测序,使用生物信息学软件对这12株PRV的PK基因序列以及GenBank登录的6条PK基因序列进行了生物信息学分析和预测。结果显示,PRV PK基因开放阅读框的核苷酸长度为1 107~1 170 bp,氨基酸长度为368~389个;核酸和氨基酸的同源性分别为96.7%~100%和73.9%~100%;在PK基因核酸序列1 079~1 099 bp和240~250 bp处有2个高变重复区;蛋白质疏水性、抗原表位的分析结果十分相似,而且PK基因编码的蛋白质均具有真核细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列。结果表明,PRV PK基因在大部分毒株具有较高的保守性。
- 张博郭万柱邹蔚然徐志文王印王小玉
- 关键词：伪狂犬病病毒蛋白激酶基因生物信息学
- H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2011年
- 采用RT-PCR方法成功扩增了H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)四川分离株(A/Swine/Sichuan/01/2006)的NS1基因,将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET32-NS1。将该质粒转化进大肠杆菌Rosetta^(TM),经终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE电泳表明融合的NS1蛋白得到了大量的表达,该融合蛋白的相对分子质量约为43 500。Western-blotting结果显示该蛋白能与阳性血清发生特异性反应具有很好的免疫反应原性。结果表明,所建立的ELISA方法与几种常见猪群传染病病原无交叉反应,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可进一步优化应用于临床SIV的检测。
- 张博郭万柱徐志文王印朱玲孙志勇王小玉
- 关键词：NS1基因原核表达间接ELISA
- 联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建被引量：9
- 2009年
- 将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2。采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液。PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株。细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU。分别以1×105PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性。此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功。
- 徐志文郭万柱陈杨石恬朱玲王印张博王小玉
- 关键词：猪细小病毒伪狂犬病病毒
- PRV基因缺失株在体外细胞中增殖的超微结构被引量：5
- 2009年
- 用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株和本实验室构建的系列PRV基因缺失株(PRV-TK-、PRV-gI\gE-、PRV-TK\gI\gE-株)感染不同的细胞系(IBRS-2、Marc145、ST、Vero、MDBK细胞),对感染细胞的形态学观察发现,受试各PRV毒株在以上细胞均能增殖并引起细胞病变,但对不同的细胞却表现差异,其中在ST细胞上增殖滴度最低,在MDBK上最高;同PRV Fa株相比,PRV-gI\gE-和PRV-TK\gI\gE-株的增殖力有所降低,而PRV-TK-则变化不明显;对细胞感染后的超微结构分析发现,基因缺失对该毒株在细胞上的吸附和穿入过程没有影响,但与Fa株相比,主要表现为增殖速度的减缓和病毒粒子数量的减少。
- 徐志文郭万柱朱玲徐凯王印王小玉
- 关键词：细胞感染形态学超微结构
- 高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测被引量：1
- 2010年
- 将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNAStar软件进行序列分析。结果表明,SC-JX01株Nsp2基因与GenBank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性为98.1%~99.1%,氨基酸的相似性为95.9%~98.0%,具有相同的30个氨基酸缺失。本研究表明,SC-JX01株Nsp2基因与分离自不同地区高热病毒株的Nsp2基因序列具有相同的缺失。由于SC-JX01株的Nsp2基因存在氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。
- 郭杨林华郭宇飞郭万柱
- 关键词：高致病性PRRSVNSP2基因
- 猪瘟病毒感染致外周免疫器官损伤的病理组织学观察被引量：3
- 2010年
- 将10头28日龄健康仔猪随机分成2组,其中感染组8头,对照组2头。感染组按1 mL/头颈部肌注猪瘟病毒（CSFV）石门株血毒（104TCID50/mL）进行人工感染,对照组不做任何处理。2 d后感染组仔猪体温升至40~41.5℃,稽留不退,而对照组体温正常。采集体温升高的仔猪扁桃体,运用RT-PCR方法检测,结果CSFV均为阳性,表明人工感染CSFV成功。分别于感染后4,7 d剖杀感染组和对照组仔猪各1头,剖解后观察各器官大体病变并采集脾脏和淋巴结等外周免疫器官制作石蜡切片,观察病理组织学变化;其余感染组仔猪分别于感染后13,16（2头）,19,23,31 d自然死亡,死亡后按剖杀猪方法同样处理。组织学观察显示：随着病情的发展,感染组仔猪的脾脏和淋巴结的淋巴滤泡逐渐发生萎缩、甚至消失,脾脏的动脉周围淋巴鞘、淋巴结的副皮质区细胞亦逐渐减少坏死,即造成了T、B淋巴细胞的渐进性减少,而对照组无异常变化。结果表明：CSFV感染仔猪后,可引起脾脏淋巴结的淋巴细胞渐进性变性与坏死,造成免疫损伤。
- 梅淼徐志文余庆刘彬尹雪琴刘万铃
- 关键词：猪瘟病毒病理组织学
