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应用重组乳糖酶LacLM生产无乳糖奶的研究: 2009年; 为明确由第三军医大学基础部微生物学教研室研发的重组乳糖酶LacLM的工业价值和应用方式,采用葡萄糖氧化法(GOD/POD)测定了该酶水解乳糖的酶学特性,以及对牛奶中所含乳糖的水解率。实验测得该酶对乳糖的Km和Vmax值分别是13.9±1.05mM和14.1±0.31μmol glucose/(min·mg)protein。该酶水解乳糖的最适温度和pH分别为37℃和7。在10℃下每升牛奶加入40mg酶可以在12h内完全水解牛奶中的乳糖;在25℃下每升牛奶加入5mg酶可以在18h内完全水解牛奶中的乳糖;在37℃下添加2.5mg酶就能在10h内完全水解牛奶中的乳糖。试验结果表明,重组乳糖酶LacLM可以直接加入牛奶中,在低温或常温下去除牛奶中的乳糖,适合用于无乳糖奶的工业化生产。; 潘渠李晋川王竞谭银玲朱晓燕陈志谨胡福泉; 关键词：牛奶乳糖不耐受

嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达被引量：7: 2008年; 嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的异源二聚体β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶2家族,由两个部分重叠、协同翻译的基因编码(lacL和lacM)。【目的】克隆表达该酶并测定其酶学特性。【方法】参照已全基因组测序的嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株基因组为模板,将lacL的RBS到lacM的终止子之间的序列(2834bp)克隆到pQE31质粒上,并电转化JM109菌株。以下列步骤纯化表达产物:硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻层析。以凝胶排阻层析测定纯化酶的天然分子量,以邻硝基苯基半乳糖为底物测定其酶学特性。【结果】实现了该酶在JM109菌株中的可溶性表达。其氨基酸序列有一处不同于嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,即其大亚基(LacL)的第512位氨基酸不是组氨酸而是精氨酸。纯化酶比活力为226U/mg蛋白,天然分子量为96.3±4.6kDa,最适pH为7,最适温度为49℃,Km和Vmax值分别是:2.18±0.12mmol/L,273±5U/mg蛋白。; 潘渠李晋川丛延广刘丽娜朱军民胡福泉; 关键词：Β-半乳糖苷酶克隆表达纯化 KM值

嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化被引量：8: 2009年; 目的分离纯化嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356的3-磷酸甘油醛脱氢酶。方法利用硫酸铵分级沉淀法、亲和层析、阴离子交换和分子筛层析对嗜酸乳杆菌GAPDH进行了分离纯化。通过N端测序鉴定了纯化产物;并用分子筛测定了嗜酸乳杆菌GAPDH的相对分子质量(Mr)。结果纯化产物在SDS-PAGE胶上呈现Mr为3.7×104的单一条带,产量为0.9 mg/L(嗜酸乳杆菌培养物)。N端测序结果证明纯化产物为嗜酸乳杆菌GAPDH。分子筛测定的GAPDH的Mr为7.08×104,表明嗜酸乳杆菌GAPDH是二聚体。结论通过该纯化方案,可大量获得电泳纯的嗜酸乳杆菌GAPDH,为进一步研究其免疫功能以及开发为免疫促进剂打下了基础。; 潘渠丛延广侯瑞陈志谨胡福泉邱岳王广科; 关键词：3-磷酸甘油醛脱氢酶嗜酸乳杆菌纯化二聚体

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6生物学活性工作标准品的校准和稳定性研究: 2013年; 目的对聚乙二醇化重组人白细胞介素-6生物学活性工作标准品进行校准和稳定性研究。方法按《中国药典》三部(2010版)的要求,检测工作标准品的生物学活性,以IL-6国际标准品进行校准,并研究其在不同温度下放置的稳定性。结果聚乙二醇化重组人白细胞介素-6工作标准品经8次试验,每次分别在3个96孔板上检测生物学活性,并以国际标准品进行校准,共获得24个校准活性结果。平均生物学活性的95%可信区间为2.0×106～3.8×106AU/mL,单次测定范围为1.9×106～3.8×106AU/mL,平均可信限率为3.771%。工作标准品分别在-20℃、4℃、25℃、37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论所制备的工作标准品可用于聚乙二醇化重组人白细胞介素-6中试工艺的研究和每批产品质量的评价。; 邓杰张珂饶海林王智杰赵兆曾海鹏李晓容周宇袁涛; 关键词：生物学活性工作标准品稳定性

一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释被引量：1: 2009年; 在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumCICC 6002)中发现了1个隐蔽质粒(pLP2111),并将其克隆到pUC 18质粒上进行测序。序列分析表明pLP2111大小为2 111 bp;仅有1个ORF,编码1个37.0 kDa的复制蛋白;有1个17 bp的重复序列重复了13次。BLAST结果显示pLp 2111和植物乳杆菌CCM1904菌株的pLP1质粒相似性最高,为99%,pLP2111比pLP1大18 bp.pLP2111可能构建为良好的乳杆菌或乳球菌异源蛋白表达载体。; 潘渠胡袁邓林雷舜胡晓梅胡福泉; 关键词：植物乳杆菌测序注释

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6工作标准品的制备被引量：3: 2012年; 目的制备重组人白细胞介素-6(Recombinant human interleukin-6,rhIL-6)和聚乙二醇化rhIL-6(PEG-rhIL-6)理化工作对照品和rhIL-6冻干体外生物学活性工作标准品,用于PEG-rhIL-6制备过程中各步样品纯度、理化指标及体外生物学活性测定。方法制备rhIL-6和PEG-rhIL-6,并对其进行全面检定,作为理化工作对照品。另取精确定量的rhIL-6,用含冻干保护剂的缓冲液稀释分装冻干,制成冻干制品后对其进行全面检定及稳定性考察,作为体外冻干生物学活性工作标准品。结果两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品各项常规检测指标均符合暂定规程要求;两种理化工作对照品结构分析结果证实与理论值相符;冻干体外生物学活性工作标准品加速稳定性试验证明其体外活性稳定。结论制备的两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品可用于PEG-rhIL-6中试工艺的研究和评价。; 袁涛张珂李征王智杰邓杰周宇赵兆饶海林张雪梅; 关键词：聚乙二醇化白细胞介素6 工作标准品

PEG-rhIL-6与rhIL-6在化疗模型小鼠中体内药效的比较研究被引量：2: 2011年; 为了研究本单位研制的聚乙二醇化重组人白细胞介素-6(PEG-rhIL-6)在动物体内的药效是否优于未经修饰的重组人白细胞介素-6(rhIL-6)。将健康的雌性BALB/c小鼠分成模型对照组、rhIL-6低、中、高剂量实验组、PEG-rhIL-6低、中、高剂量实验组和空白对照组进行试验,检测小鼠用药前后血小板和体重的动态变化。结果表明PEG-rhIL-6具有减缓环磷酰胺致小鼠血小板减少的作用。高剂量的PEG-rhIL-6与高剂量的rhIL-6相比,减缓血小板减少程度的作用更强(t=2.42,P=0.017),血小板恢复也更快,显示了更好的药效作用。同时PEG-rhIL-6和rhIL-6均可抗环磷酰胺对小鼠体重增长的抑制作用。; 袁涛王智杰邓杰张珂李征张雪梅; 关键词：血小板减少症

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6药效研究被引量：3: 2010年; 目的探讨体内外不同修饰度的聚乙二醇(PEG)化重组人白细胞介素-6(rhIL-6)的药效。方法以相对分子质量20000的PEG2-NHS修饰剂化学耦合修饰rhIL-6,利用毛细管电泳仪分离得单修饰PEG-rhIL-6(mono-PEG-rhIL-6)和双修饰PEG-rhIL-6(di-PEG-rhIL-6),采用标准方法(即7TD1细胞/MTT比色法)测定体外IL-6的生物学活性,参考品为已标定的rhIL-6。体内实验:小鼠腹腔注射环磷酰胺构建BALB/c小鼠模型,分为模型组、阳性对照组、mono-PEG-rhIL-6高剂量组、mono-PEG-rhIL-6低剂量组、di-PEG-rhIL-6高剂量组和di-PEG-rhIL-6低剂量组。各组按上述剂量1次/d皮下注射给药,连续5d,于给药的第3天各组小鼠同时腹腔注射环磷酰胺,每日1次,连续3d。于给药的第8、11、14、17天切尾采血测定各小鼠血小板数并进行统计学处理。结果体外生物活性检测表明,mono-PEG-rhIL-6与di-PEG-rhIL-6相差不大,均比rhIL-6低10倍;体内活性测定表明,阳性对照组、mono-PEG-rhIL-6和di-PEG-rhIL-6的高、低剂量组小鼠血小板数回升速度较同时期模型组快,它们之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 PEG单修饰和多修饰(≥2)的rhIL-6在体外均具有促7TD1细胞增殖的活性;在体内均具有抗环磷酰胺致小鼠血小板减少的作用。mono-PEG-rhIL-6和di-PEG-rhIL-6均是药物的主要成分。; 张雪梅张珂饶海林邓杰袁涛王智杰赵兆曾海鹏李晓容尹海林何令学; 关键词：白细胞介素-6 血小板减少

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达被引量：2: 2009年; 目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b-lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2.28kU/L.而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。; 潘渠胡福泉陈恬邱岳王广科李晋川; 关键词：嗜酸乳杆菌 Β-半乳糖苷酶克隆表达 HIS-TAG 复性

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四川省科技攻关计划(05SG022-019)

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