国家自然科学基金(30671008)
- 作品数：20 被引量：21H指数：3
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- 人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
- 2007年
- 目的构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测MCHR1的表达。结果成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础。
- 袁成福杨俊霞魏丽丽石华陈济易发平马永平宋方洲
- 关键词：真核表达载体CHO细胞转染
- 人hIL-24△103重组腺病毒的制备及其对A549细胞生长及凋亡的影响
- 白细胞介素24(interleukin 24,IL-24)是近年来新发现的一个 IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性。为了研究开发高活性、低分子量的 IL-24并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性, 本研究在前期基础...
- 卜友泉丁嵩涛魏丽丽张琴罗耀玲易发平宋方洲
- 关键词：人白介素24腺病毒细胞增殖
- 稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立
- 2009年
- 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论:成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。
- 张琴卜友泉易发平袁成福秦琴宋方洲
- 关键词：真核表达载体基因表达
- 人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立被引量：2
- 2007年
- 目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系.方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,WesternBlot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因.结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.
- 杨俊霞石华魏丽丽袁成福陈济易发平马永平宋方洲
- 关键词：真核表达载体转染基因表达
- 黑色素浓集激素受体与肥胖被引量：1
- 2006年
- 黒色素浓集激素(melanin-concentratinghormone,MCH)是一种含有19个氨基酸的神经肽,主要存在于下丘脑。它有MCHR1和MCHR2两种G蛋白偶联受体,两种受体的分布及在大脑中的表达基本相似,但MCHR2不存在于啮齿动物中。MCHR1可与多种G蛋白偶联而MCHR2主要与Gq蛋白偶联。MCH与受体结合后将介导不同的信号通路。MCH是机体能量稳态系统中一种关键调节因子,与肥胖发生有关。
- 袁成福宋方洲
- 关键词：神经肽信号通路肥胖
- 蛋白质组学技术在研究AdIL-24抗癌机制中的应用
- 2007年
- 目的:探讨蛋白质组学技术在研究AdIL-24抗宫颈癌CaSki细胞作用机制的应用价值。方法:前期研究已成功构建AdIL-24,可抑制宫颈癌CaSki细胞生长,促进凋亡。在此基础上,通过双向凝胶电泳分离AdIL-24处理前后细胞总蛋白,并对胶条(pH3-10NL、pH4-7)、SDS-PAGE浓度(10%、12%)、电泳时间(6h、7h)进行优化,PDQuest图像分析,MALDI-TOF质谱鉴定,经Mascot、MS-fit软件查询SWISS-PORT数据库鉴定差异蛋白。结果:获得分辨率高、重复性好的CaSki细胞双向电泳图谱,质谱鉴定的差异蛋白点经Mascot、MS-fit软件搜索到同一种蛋白质。结论:已建立的蛋白质组学技术,为进一步研究AdIL-24的抑癌机制奠定基础。
- 魏丽丽王中堂崔涛易发平宋方洲
- 关键词：CASKI细胞蛋白质组学
- 人MCHR2基因shRNA真核表达载体体外转染
- 2008年
- 目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率。结果与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上。
- 袁成福刘革力卜友泉易发平马永平宋方洲
- 关键词：短发夹RNA真核表达载体细胞转染
- 高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡
- 2008年
- 目的:构建人c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定表达细胞系;以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方法:以pD-BLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His B,经PCR和酶切鉴定,DNA测序正确,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定表达细胞系.RT-PCR,Western Blot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达,流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用.结果:成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定表达细胞系,成功地表达目的基因;与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡.结论:JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡,为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.
- 韩卿宋方洲易发平卜友泉李长燕杨晓明
- 关键词：真核表达载体转染基因表达细胞凋亡
- 敲减人MCHR2基因抑制CHO细胞的放射性配体受体结合能力及Ca^2＋释放被引量：1
- 2008年
- 研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2表达及特征的影响．将pGenesil-1-MCHR2-shRNA转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中，通过RT-PCR和Western印迹检测MCHR2表达的变化；放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量Bmax及平衡解离常数Kd值的变化；钙流检测实验观察配体MCH刺激后单个细胞Ca^2＋释放及MCH半数有效浓度EC50的变化,与转染pGenesil-1空载体组比较，pGenesil-l-MCHR2-shRNA能使MCHR2基因mRNA表达减少45．8％～66．4％；蛋白表达减少44．2％～81．0％；Bmax减少39．4％～78．7％，Kd值升高40．9％～81．9％；EC50升高114．8％～822．4％．MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效抑制MCHR2基因的表达，减少Bmax、升高虬值及EC50，从而对MCHR2生物活性等特征产生影响。
- 袁成福杨俊霞刘革力卜友泉张琴易发平马永平宋方洲
- 关键词：基因表达生物特征
- JNK3重组腺病毒促进表柔比星诱导的人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡被引量：1
- 2008年
- 目的:构建人JNK3基因重组腺病毒,检测其对人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响;以表柔比星作为凋亡诱导剂,检测其对细胞凋亡的影响。方法:以pDBLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-JNK3,线性化后与骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,经PCR方法鉴定后,用包装后的病毒上清感染人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,Western印迹方法检测JNK3蛋白的表达;MTT实验检测其对细胞增殖的影响;流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测表柔比星诱导的细胞凋亡情况。结果:核酸测序和PCR鉴定表明成功构建Ad-JNK3,终点稀释试验测定扩增的腺病毒滴度为6.5×1010pfu/ml;Ad-JNK3在SH-SY5Y细胞中表达JNK3蛋白;MTT检测结果表明Ad-JNK3可抑制SH-SY5Y细胞生长,抑制率为28.08%;流式细胞术结果表明Ad-JNK3可明显促进表柔比星诱导的细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳可观察到DNA梯形条带。结论:重组腺病毒Ad-JNK3能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,促进表柔比星诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,为研究JNK3的作用机制及将其用于人成神经细胞瘤的基因治疗提供了条件。
- 韩卿宋方洲易发平卜友泉王治东李长燕杨晓明
- 关键词：JNK丝裂原活化蛋白激酶类重组腺病毒表柔比星细胞凋亡
