山东省科技发展计划项目(2004GG3202003)
- 作品数：6 被引量：16H指数：2
- 相关作者：孙青崔晶林阿丽时昌文刘群更多>>
- 相关机构：山东省千佛山医院山东大学杭州市第三人民医院更多>>
- 发文基金：山东省科技发展计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢病毒介导的hGM-CSF修饰的肿瘤疫苗免疫活性研究
- 2013年
- 目的构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)的慢病毒载体,研究编码hGM-CSF的慢病毒载体对树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法以质粒pORFhGM-CSF为模板,采用PCR方法扩增出hGM-CSF基因片段;通过BamH I和Xho I限制性内切酶位点,将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM-CSF。将重组载体L166-hGM-CSF和包装载体L205以及包膜载体L311共同转染慢病毒包装细胞293T,72h后收集病毒上清液获得编码hGM-CSF的慢病毒颗粒LentihGM-CSF。从脐血中分离出单核细胞,rhGM-CSF、rhIL-4和α-TNF诱导获得DC,通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定。应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原,分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti-hGM-CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养,MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对反应细胞的体外杀伤活性。结果编码hGM-CSF的慢病毒载体L166-hGM-CSF成功构建,获得了编码hGM-CSF的慢病毒。该慢病毒的Hela细胞上清液中hGM-CSF的表达明显高于未感染者。从脐血中分离出的DC,显示其高表达CD80(87.2%)和CD86(92.8%),而单核细胞标志CD14的表达率较低(3.56%)。慢病毒介导的分泌hGM-CSF的树突状细胞肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较普通DC疫苗明显增强(P<0.01)。结论本实验制备的慢病毒Lenti-hGM-CSF感染反应细胞后能够显著增强DC肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力及其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力,为hGM-CSF修饰的DC肿瘤疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。
- 林阿丽孙青
- 关键词：慢病毒载体粒细胞巨噬细胞集落刺激因子树突状细胞肿瘤疫苗
- 负载hTERT基因片段的慢病毒的包装及表达被引量：2
- 2008年
- 目的构建编码人端粒酶逆转录酶(hTERT)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hTERT基因在体外的表达情况。方法采用RT-PCR获得hTERT基因片段,插入转移载体L166,用CaCl2法L166-hTERT、L205、L311共转染293T细胞包装慢病毒,测定病毒滴度,免疫细胞化学法检测慢病毒感染的293T细胞中hTERT的表达。结果测序结果显示成功构建了重组质粒L166-hTERT,测定未经浓缩的病毒滴度为5.25×106IU/mL,免疫细胞化学法检测到慢病毒感染的293T细胞中hTERT呈阳性表达。结论成功构建了负载hTERT基因片段的慢病毒,hTERT能在感染的293T细胞中高效表达,表达持续2个月以上。
- 崔丽萍崔晶时昌文孙青
- 关键词：人端粒酶逆转录酶慢病毒载体肿瘤疫苗
- 负载hTERT基因片段的DC肿瘤疫苗制备及其抗肿瘤作用的研究被引量：8
- 2010年
- 目的:研究负载hTERT基因片段的树突状细胞(DC)肿瘤疫苗及其抗肿瘤作用。方法:构建负载hTERT基因片段的慢病毒载体,采用细胞免疫化学技术检测Lenti-hTERT转导的293T细胞中hTERT基因的表达;分离制备脐血来源的DC,通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定;Lenti-hTERT转导DC细胞制备DC疫苗;DC疫苗刺激同种T淋巴细胞诱导特异性CTL并用MTT法检测其增殖能力和对靶细胞的特异性杀伤能力。结果:成功构建负载hTERT基因片段的Lenti-hTERT,病毒滴度达5.88×106U/mL;转导后细胞中hTERT的表达显著升高,持续时间>2个月;分离制备脐血来源的DC,经慢病毒转导成为负载hTERT的DC疫苗,负载了hTERT抗原的DC刺激淋巴细胞增殖的能力明显优于未负载hTERT的DC(P<0.01),增殖指数均>1.5。负载了hTERT抗原的DC诱导CTLT对HepG2肝癌细胞的杀伤能力明显高于未经修饰的DC所诱导CTLN(P<0.01),抑瘤率分别为54.78%和12.08%;对hTERT阴性的293T细胞CTLN和CTLT的抑制率均较低且差异无统计学意义,P>0.05。结论:用慢病毒介导hTERT修饰制备的DC疫苗,其刺激T细胞增殖的能力增强,诱导的CTL对端粒酶阳性的HepG2肿瘤细胞具有特异而且显著增强的杀伤效应。
- 崔晶崔丽萍孙青
- 关键词：HTERT慢病毒载体肿瘤疫苗免疫化学树突细胞
- 肿瘤干细胞在肿瘤转移过程中的作用被引量：2
- 2012年
- 肿瘤干细胞（NSC）是一种增殖特性失控可形成肿瘤的具有干细胞特性的细胞，在肿瘤转移中起重要作用，其作用机制贯穿于肿瘤发生、发展以及转归等过程中。
- 贾茹孙青
- 关键词：肿瘤干细胞肿瘤转移
- 编码hGM-CSF基因的慢病毒包装及表达被引量：2
- 2007年
- 目的:构建编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)慢病毒载体转染小鼠结肠癌细胞CT26,建立持续高表达hGM-CSF基因的CT26细胞株。方法:采用PCR法获得hGM-CSF DNA片段,插入转移载体L166;用CaCl2法将载体L166-hGM-CSF、L205和L311共同转染到慢病毒包装细胞293T中,72 h后收集上清液。测定慢病毒的滴度;用ELISA法检测慢病毒感染后的CT26细胞上清液中hGM-CSF的表达。结果:通过酶切电泳证实重组转移载体L166-hGM-CSF含有预期的hGM-CSF片段。收集慢病毒转染CT26细胞,滴度达4.69×105IU/ml。ELISA法检测慢病毒转染的CT26细胞上清液中有hGM-CSF的表达超过2个月。终浓度15μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出单克隆CT26细胞株。结论:收集的慢病毒能够有效的将其所携带的目的基因导入CT26细胞并使其在细胞中高效持续表达2个月以上。
- 林阿丽孙青
- 关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子慢病毒载体癌症疫苗
- 负载hGM-CSF基因的慢病毒载体介导的宫颈癌DC疫苗抗肿瘤活性的初步研究被引量：2
- 2010年
- 目的:制备负载hGM-CSF基因的宫颈癌DC疫苗并研究其抗肿瘤作用。方法:(1)分离制备脐血来源的DC,通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定;(2)Lenti-hGM-CSF转导DC细胞,ELISA方法检测DC细胞上清液中hGM-CSF的含量。宫颈癌HeLa细胞冻融抗原刺激DC细胞制备DC疫苗;(3)DC疫苗刺激同种T淋巴细胞诱导特异性CTL并用MTT法检测其增殖能力和对靶细胞的特异性杀伤能力。结果:(1)经Lenti-hGM-CSF转导后DC培养液中hGM-CSF含量明显高于未转染的DC细胞(P<0.01);(2)Lenti-hGM-CSF转染的宫颈癌DC疫苗刺激淋巴细胞的增殖指数(SI)达2.16,明显优于未转染的宫颈癌DC疫苗;(3)经Lenti-hGM-CSF修饰的宫颈癌DC疫苗诱导的CTL对宫颈癌HeLa细胞的杀伤活性达51.12%,高于未经修饰的DC诱导的CTL(P<0.05)。结论:用Lenti-hGM-CSF修饰制备的宫颈癌DC疫苗,其刺激T细胞增殖的能力增强,诱导的CTL对宫颈癌HeLa细胞具有显著增强的杀伤效应。
- 崔晶林阿丽刘群孙青
- 关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子慢病毒载体DC疫苗肿瘤疫苗
