国家自然科学基金(31100024)
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 相关作者：张惟材汪建华熊向华葛欣韩月梅更多>>
- 相关机构：军事医学科学院沈阳药科大学广西医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 甲基营养菌MP688胞外多糖合成的影响因素研究
- 2013年
- 目的：考察培养基组分和发酵条件对甲基营养菌MP688合成胞外多糖的影响，确定最主要的影响因素。方法：将甲基营养菌MP688接种到基础培养基中，通过改变基础培养基的氮源、培养温度、初始pH值和培养时摇床转速等条件，检测在每种条件下培养5 d后发酵液中的多糖含量，确定每种因素的最适范围；进而选取8个因素，通过Plackett-Burman实验设计12组实验，通过检测每种组合条件下的多糖产量和结果统计分析，确定影响多糖合成的最主要因素。结果：甲基营养菌合成胞外多糖的最适氮源为硝酸钠，最适温度为30-37°C，最适pH值为6.5-7.0，最适摇床转速为200-250 r/min；甲醇、硝酸钠、初始pH值和接种量是MP688合成多糖的主要影响因子。结论：运用Plack-ett-Burman实验设计筛选到甲基营养菌MP688胞外多糖合成的主要影响因子，MP688是具有多糖生产潜力的菌株。
- 葛欣韩月梅熊向华汪建华刘党生张惟材
- 关键词：甲基营养菌胞外多糖
- 氧化葡糖杆菌sndh-sdh基因簇的克隆表达被引量：1
- 2012年
- 目的:从氧化葡糖杆菌H763中克隆sndh-sdh基因簇,在大肠杆菌和氧化葡糖杆菌621H中分别表达山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶(SNDH-SDH),并检测其活性。方法与结果:以氧化葡糖杆菌H763基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及终止序列在内的sndh-sdh基因簇,回收3533 bp的扩增产物,连入pMD18T载体,转化至大肠杆菌DH5α中表达;以山梨糖或木糖为底物,DCIP法检测菌体裂解液,DCIP检测液颜色由蓝绿色变为黄色,表明大肠杆菌表达产物具有脱氢酶活性。构建pBBR1MCS2-sndh-sdh载体,通过接合转移导入氧化葡糖杆菌621H,重组葡糖杆菌在以山梨醇或山梨糖为底物的培养基中培养,采用薄层层析检测法检测其培养上清中的代谢产物,层析板上显示了2-酮基-L-古龙酸斑点。结论:重组大肠杆菌DH5α和氧化葡糖杆菌621H中均表达了有脱氢酶活性的SNDH-SDH。
- 侯伟熊向华陈微微汪建华舒伟袁志刚张惟材
- 关键词：山梨糖脱氢酶2-酮基-L-古龙酸
- 酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化被引量：1
- 2011年
- 目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。
- 韩双熊向华汪建华游松张惟材
- 关键词：纯化
- 甲基营养菌MP688葡萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究被引量：4
- 2013年
- 目的:鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法:对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计引物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载体pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果:分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ_2164的氨基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ_2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论:MPQ_2164是一个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源表达。
- 王文溪葛欣韩月梅熊向华汪建华张景海张惟材
- 关键词：甲基营养菌表达纯化吡咯喹啉醌
- 酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测
- 2013年
- 目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果:扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×103;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论:在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。
- 赵楠熊向华葛欣汪建华夏焕章张惟材
- 关键词：原核表达生物活性活性电泳
- 酮古龙酸菌Y25 D-2-羟酸脱氢酶的表达、纯化与酶学性质被引量：1
- 2014年
- 目的克隆酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶(2-hydroxyacid dehydrogenase,HADH)基因hadh,并在大肠杆菌中进行表达、纯化和酶学性质检测。方法 PCR扩增酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶基因hadh,构建表达载体pTIGhadh,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌进行诱导表达,表达产物经Ni+亲和层析柱进行纯化后进行酶学性质检测。结果 SDS-PAGE分析结果显示,重组菌中HADH表达量可达菌体总蛋白的50%以上,相对分子质量约35×103。酶学性质检测结果表明,纯化的HADH以2-酮基古龙酸(2-keto-gulonic acid,2-KGA)为底物,最适pH 8.0,最适温度45℃,几种常见金属离子和螯合剂对HADH的活性影响微弱或无影响,以2-KGA为底物时的HADH最大反应速度27 U/mg,Km值为2.6 mmol/L,体内酶活检测结果表明,HADH能够代谢2-KGA。结论重组HADH在大肠杆菌中获得了高效表达,并研究了其酶学性质,为后续山梨糖代谢通路研究和进一步提高糖酸转化率奠定了基础。
- 梁钰英熊向华朱斌赵楠汪建华张惟材
- 关键词：纯化
- 山梨糖脱氢酶在脱氮副球菌中的表达被引量：2
- 2012年
- 目的:在脱氮副球菌PD1222中表达山梨糖脱氢酶(SDH)。方法:从质粒pMD-18T上复制氨苄西林抗性基因Ampr,从酮古龙酸菌中复制SDH基因sdh,先后酶切连接到pIND4质粒上,构建pIND4-Ampr-sdh穿梭质粒;再把pIND4-Ampr-sdh电转入大肠杆菌S17-1λpir作为供体菌,脱氮副球菌PD1222为受体菌进行双亲本接合转移;挑取壮观霉素和氨苄西林双抗平板上的接合子进行培养,菌液PCR复筛接合子,测序鉴定,通过DCIP法和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测阳性克隆的SDH活性。结果:构建的质粒pIND4-Ampr-sdh成功转入脱氮副球菌PD1222中,SDH获得表达并检测到其蛋白活性。结论:实现了SDH在脱氮副球菌中的表达,为在脱氮副球菌中研究SDH的下游电子传递链奠定了基础。
- 朱斌熊向华汪建华何建勇张惟材
- 关键词：山梨糖脱氢酶脱氮副球菌
