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嵌合γδ TCR结构域的αβ TCR分子的同源建模及真核表达: 2016年; 目的设计并构建嵌合γδTCR类免疫球蛋白(Ig)结构域的αβTCR分子,并在Jurkat T细胞中观察其表达。方法通过生物信息学分析确定TCR△Ig分子的融合位点;应用同源建模模拟嵌合TCRα和TCRβ蛋白的三维结构,并应用组合扩展方法(CE)对TCR△Ig分子与野生型TCR分子的蛋白骨架以及抗原识别活性部位进行空间结构比对和分析。采用重叠PCR法分别在TCRα△Ig和TCRβ△Ig的末端融合增强型青色荧光蛋白(ECFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP),并分别克隆入质粒p IRES2-EGFP内部核糖体进入位点(IRES)的上下游。最后将重组表达质粒p IRES-TCRβ△Ig-EYFP/TCRα△Ig-ECFP转染Jurkat T细胞,共聚焦显微镜扫描分析该嵌合TCR分子的表达。结果 TCRα△Ig和TCRβ△Ig的同源建模及三维结构比对结果显示,相比于野生型TCR,该嵌合TCR的可变区(V)结构无改变并且抗原识别活性中心结构保持稳定。重组表达质粒经PCR鉴定及测序分析证明载体构建成功;并且共聚焦显微镜扫描结果显示嵌合TCR分子能定位于T细胞膜表面并正常表达。结论该嵌合TCR分子设计合理,能在Jurkat T细胞表面正常表达。; 陶嫦立邵红伟沈晗黄树林; 关键词：T细胞受体蛋白结构预测同源建模融合基因

甘草水提物中miRNA对人免疫细胞基因表达的影响被引量：25: 2017年; 微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA,其调控基因表达、影响细胞活性的功能已为人们所重视。近年来miRNA的跨界调控成为新的研究方向,为人们更全面地认识和了解miRNA的功能提供了新的视角。植物miRNA由于通常经过了甲基化修饰,因此较为稳定,不易降解。前期研究表明,甘草干燥药材的水煎剂中存在着丰富的小分子RNA,这为了解甘草的作用机制提供了新的思路。在本研究中,利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物(mimic)作用于分离自健康人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR)基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行了分析。结果表明甘草miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用,能够显著抑制T细胞分化相关基因的表达,以及炎症和凋亡相关基因的表达。这为进一步更全面地了解甘草的作用机制以及中药新药的研制带来了新的思路。; 向静黄洁嫦徐畅何免徐鹏程张丹张文峰沈晗邵红伟; 关键词：小分子RNA 基因表达

加味黄芪补气汤促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖及活化的研究被引量：10: 2017年; 目的:研究加味黄芪补气汤对肿瘤患者外周血淋巴细胞的促增殖及活化作用。方法:以黄芪和苦参为主药,辅以适量人参、黄精及甘草,制备加味黄芪补气汤。分离5位肿瘤患者的外周血淋巴细胞,分别将补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱作用于淋巴细胞。细胞计数法检测各组淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-2含量;ELISPOT法检测各组细胞分泌IFN-γ的情况。结果:加味黄芪补气汤浓度为2.5、5.0μg/m L(原药冻干物)时能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖,其中浓度为2.5μg/m L时效果最好,与对照组相比具有统计学意义(P<0.01);黄芪甲苷浓度为2.0、4.0μg/m L时能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞的增殖,其中4.0μg/m L时效果最好(P<0.01);氧化苦参碱各浓度对肿瘤患者外周血淋巴细胞的增殖基本无影响(P>0.05);IL-2分泌水平检测显示,加味黄芪补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱浓度分别为2.5、4.0、8.0μg/m L时,较组内其他浓度效果较好,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);IFN-γ的ELISPOT实验结果显示,加味黄芪补气汤、黄芪甲苷、氧化苦参碱浓度分别为2.5、4.0、8.0μg/m L时,阳性细胞计数最多,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。结论:加味黄芪补气汤在一定浓度范围内能够促进肿瘤患者外周血淋巴细胞增殖与活化,其中黄芪的有效成分黄芪甲苷参与淋巴细胞的增殖与活化过程,而苦参的有效成分氧化苦参碱可能只参与活化淋巴细胞的作用。; 谌天娇寇敬高淑慧瞿创薄华本王辉张帆沈晗; 关键词：氧化苦参碱黄芪甲苷外周血淋巴细胞

TCR基因免疫治疗中优化转TCR基因配对的研究进展被引量：1: 2016年; TCR基因修饰T细胞的过继性免疫治疗是指将识别肿瘤抗原的特异性TCR基因转导至外周血T细胞,经大量扩增后回输给患者,从而发挥抗肿瘤效应的一种治疗技术。目前TCR基因治疗所面临的关键问题之一是如何改造修饰转TCR基因使得转TCRα链和β链在T细胞表面优先配对以提高转T细胞的功能,并避免off-target反应毒性的产生。最近,各种基因修饰策略被用于优化转TCR基因配对和减少错配。介绍了近年来针对TCR基因进行修饰改造的各种策略及TCR基因治疗的临床试验。; 陶嫦立黄树林; 关键词：T细胞受体

嵌合型TCR分子的表达与组装效率分析: 2016年; 目的通过对外源TCR分子结构域的定向改造,对嵌合型TCR双链分子的表达与组装情况进行研究,探讨其对TCR基因修饰T细胞(TCR-T)内外源TCR分子与内源TCR分子错配减少的贡献,为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗奠定基础。方法将结构域未改造的野生型TCR分子、恒定区结构域经过改造的嵌合TCR(chim-TCR)分子及杂合TCR分子转染7402细胞,通过报告基因的表达分析TCR分子的表达情况,利用荧光共振能量转移(FRET)技术计算不同的TCR分子组合在细胞中的组装效率。结果 TCR分子经过结构域定向改造后,能够在细胞内有效地表达和组装。荧光共振能量转移(FRET)分析表明嵌合型TCR与野生型TCR分子之间形成的杂合分子FRET值明显小于嵌合型或野生型自身配对的FRET值。结论结构域定向改造的嵌合型TCRα、β链与野生型α、β双链能有效得到表达及组装,并且嵌合型TCRα、β链与野生型α、β链组装配对的效率显著降低,这为改善基因修饰的T细胞过继性免疫治疗奠定了基础。; 苏畅刘婷黄帼蓉陈楚如向静徐畅张文峰沈晗邵红伟

人趋化因子CCL17和CCL22对CD4及CD8T淋巴细胞亚群的趋化能力比较研究被引量：6: 2016年; 目的探讨具有同源受体CCR4的趋化因子CCL17和CCL22对CD4和CD8 T细胞亚群的趋化能力。方法首先利用流式细胞术检测健康人外周血中CCR4^+T细胞的比例分布,接着用Mo Flo分选流式细胞仪分选出健康人外周血中的CD4细胞和CD8细胞。利用CCL17和CCL22趋化因子蛋白分别对CD4及CD8细胞进行细胞趋化实验,计算趋化指数。利用流式细胞术检测CCL17和CCL22分别作用CD4及CD8细胞后CCR4受体内化情况,计算受体内化效率。结果外周血PBMC中,CD4细胞CCR4分子的表达水平要高于CD8细胞(P<0.05)。在相同趋化时间内,CCL22对CD4和CD8 T细胞亚群的趋化能力强于CCL17(P<0.05),CCL17和CCL22趋化CD4细胞通过Transwell板的细胞数均多于CD8细胞(P<0.05),但CCL17对2种T细胞亚群趋化能力的差异性要小于CCL22。CCR4受体内化实验证实,相同时间下CCL22比CCL17更容易促使CCR4受体发生内化(P<0.05),对于CD4和CD8 T细胞亚群,CCL22作用后受体CCR4内化程度无显著性差别(P>0.05),而CCL17对CD8细胞的内化作用要强于CD4细胞(P<0.05)。结论 CCL22对CD4和CD8细胞的趋化能力均强于CCL17,而促进受体内化方面,CCL17对CD8细胞的作用更强,CCL22对这2种细胞则无显著差别。; 寇敬谌天娇邵红伟张文峰薄华本瞿创高淑慧黄树林张帆沈晗; 关键词：CD4细胞 CD8细胞趋化作用

基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒诱导T淋巴细胞胞内体膜的裂解: 2016年; 【目的】探索基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒裂解T淋巴细胞胞内体膜的实验方法。【方法】本文以Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞)为靶细胞,将pH值敏感的荧光染料pHrodo dextran与5型腺病毒(Ad5)共同孵育Jurkat细胞,对pHrodo dextran孵育的浓度与时间进行了优化,利用激光共聚焦显微镜分析胞内相对平均荧光强度百分比随时间的变化情况,反映Ad5诱导胞内体膜裂解情况。【结果】研究结果表明,在pHrodo dextran终浓度为80μg/m L,孵育时间为10 min条件下,在病毒感染后的30 min,相对平均荧光强度百分比出现显著下降;利用巴佛洛酶素A1抑制胞内体膜质子泵活性后,相对平均荧光强度百分比出现轻微下降。【结论】建立了基于pHrodo dextran分析腺病毒诱导T细胞胞内体膜裂解的新方法。; 张文峰李壮华陈镜塘邵红伟陈业诚黄树林; 关键词：腺病毒 T淋巴细胞

p53基因及NHEJ相关基因表达水平对基因组编辑效率的影响: 2019年; 目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差异。同时检测p53基因在不同细胞中的突变情况,通过RT-qPCR分析参与非同源末端连接(NHEJ)通路的17个主要基因的表达情况。结果流式检测各细胞的转染效率:293T为30.50%,HEK-293为29.30%,Hela为17.70%,SW480为21.90%,Jurkat为13.08%,K562为18.51%。根据克隆测序结果计算出各种细胞中基因组的编辑率:293T为74.70%、HEK-293为68.00%、Hela为13.47%、sw480为32.70%、Jurkat为65.52%、K562为77.18%。测序结果表明293T、Jurkat、K562细胞的p53基因发生了突变,而HEK-293、Hela和SW480的p53基因为野生型。qPCR结果显示,在编辑效率较高的细胞系中,大部分NHEJ相关基因的表达水平也较高,且其表达水平在p53功能异常细胞系中要比在p53功能正常细胞系中的高。结论本研究发现p53的异常程度以及NHEJ相关基因的表达水平与基因组编辑效率存在相关性。; 于洋孔明圣雷颖首徐畅张亚倩张一帆张文峰沈晗邵红伟; 关键词：P53 基因突变 NHEJ 修复相关基因

浆细胞样树突状细胞与肿瘤免疫被引量：3: 2018年; 浆细胞样树突状细胞(pDCs)是树突状细胞(DCs)的亚群之一,主要功能是分泌Ⅰ型干扰素,借此在抗病毒免疫中起着至关重要的作用。而在肿瘤免疫方面,相比其他DCs亚群pDCs受到的关注较少。实际上pDCs桥接着先天免疫反应和适应性免疫反应,是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。本文对近年来pDCs的研究进展及其在肿瘤免疫中的作用进行综述。; 陈桂思王悦吴婉文邹海玲沈晗; 关键词：浆细胞样树突状细胞肿瘤免疫

CCL17在肿瘤免疫反应中的研究进展被引量：5: 2019年; 趋化因子(chemoattractant cytokine ligand,CCL)是一类可趋化细胞移动的小分子肽物质,根据其分子结构中N-末端半胱氨酸的相对位置主要分为四种类型,CCL17是其中CC型的趋化因子,也被称作胸腺和活化调节趋化因子(thymus and activation regulated chemokine,TARC).趋化因子通过结合细胞表面的趋化因子受体(chemokine receptor,CCR)发挥其生物学功能,CCL17对应的膜受体为CCR4分子,主要表达于多种T淋巴细胞亚群的细胞膜表面.研究发现CCL17具有多样的生物学功能,它能够趋化CCR4阳性的细胞发生迁移作用,参与到机体的炎症、超敏反应及自身免疫性疾病等多种病理生理过程,近年来有关CCL17参与肿瘤微环境及影响机体肿瘤免疫功能的研究多有报道,研究发现CCL17可能通过调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)发挥促进肿瘤生长与转移的作用,但也有相关报道证实CCL17在特定条件下亦具有抗肿瘤免疫作用.; 王悦陈桂思邵红伟沈晗; 关键词：调节性T细胞肿瘤微环境免疫反应

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国家自然科学基金(31300737)

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