国家自然科学基金(81330007) 作品数:13 被引量:72 H指数:5 相关作者: 余细勇 霍然 杨翔宇 李晓红 杨敏 更多>> 相关机构: 广州医科大学 广东省人民医院 南方医科大学 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 广东省科技计划工业攻关项目 广东省自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 文化科学 更多>>
人工外泌体共递送siRNA和蛋白的递送系统的设计及体外评价 被引量:4 2020年 本文制备了人工外泌体,共传递蛋白和核酸,实现多组分药物高效安全共传递。采用阳离子脂质赋形剂二油酰基三甲基铵丙烷(dioleyl trimethylammonium propane, DOTAP)修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acidglycolic acid copolymer, PLGA)基质来设计优化的制剂,双乳化法制备包裹蛋白和核酸的PLGA/DOTAP纳米粒,再用逆相蒸发法制备最外层的膜结构,此膜结构由二棕榈酰磷脂酰胆碱(1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)、胆固醇及膜蛋白组成,通过超声分散和挤出的方式形成人工外泌体结构,并分析其物理特性和传递效果性质。结果表明,人工外泌体粒径约为156.13 nm,带负电荷(-18.23±0.57 mV),能高效共传递蛋白和siRNA,且siRNA能高效抑制目标基因Trim 28的表达。这说明人工外泌体模拟了外泌体结构,实现了多组分药物安全高效的共递送。 邓赛 张灵敏 王萍 李仕颖 林潮金 傅小媚 余细勇关键词:聚乳酸-羟基乙酸共聚物 脂质体 药物递送 缺氧心肌细胞来源外泌体对Gli1^+细胞纤维化表型转换的作用机制 2019年 目的 观察缺氧心肌细胞来源外泌体对Gli1 +细胞纤维化过程的影响,并探讨其可能的机制。方法 分离Gli1 +细胞和SD乳鼠心肌细胞。心肌细胞分别进行常氧和缺氧培养,收集培养基并提取外泌体,用透射电镜、Nanosight、Western blot等方法对其鉴定。两种外泌体分别与Gli1 +细胞共培养。RT-qPCR法检测这两种外泌体并对比分析,明确其中起关键调控作用的miRNA。转染miRNA模拟物观察Gli1 +细胞中纤维化相关蛋白的表达水平。结果 Gli1 +细胞强阳性表达CD29、CD105和Gli1,不表达CD31、CD34和CD45。心肌细胞表达cTnT和α-Actinin,其外泌体直径约100 nm,并检测到Flotillin-1、Alix、HSP-70和CD63。缺氧处理外泌体中miR-223明显上调( P <0.01);Gli1 +细胞经缺氧外泌体和 miR-223 mimic处理,纤维化相关的蛋白α-SMA( P <0.01, P <0.05)、DDR-2( P <0.01, P <0.01)和collagen I( P <0.05, P <0.01)的表达都明显升高。结论 缺氧心肌细胞外泌体能促进Gli1 +细胞内纤维化相关蛋白的表达,使其向纤维化表型转换,这一作用可能与外泌体中高表达的miR-223有关。 林潮金 秦爱萍 李松沛 霍然 邓赛 傅小媚 向杨 余细勇关键词:GLI1 缺氧 外泌体 纤维化 青蒿琥酯对小鼠巨细胞病毒性肺炎的治疗作用 被引量:5 2020年 为了探索青蒿琥酯对小鼠巨细胞病毒性肺炎的治疗作用及其机制,应用滴鼻法建立携带绿色荧光蛋白的小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus-green fluorescent protein,MCMV-GFP)感染的巨细胞病毒性肺炎模型。动物福利和实验过程均遵循广州医科大学动物伦理委员会的规定。将BALB/c-nu小鼠随机分为5组:空白对照组、巨细胞病毒肺炎模型组、青蒿琥酯60、120和240 mg·kg^-1组。观察小鼠生存期和肺组织病理变化,并进一步进行分子机制研究。分别采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法检测肺组织的病理变化;荧光定量PCR(polymerase chain reaction)方法检测肺组织中MCMV主要即刻早期基因1(major immediate early 1,Mie1)mRNA的表达;免疫荧光法检测MCMV-GFP的表达;ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)检测肺上清炎症因子白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、IL-10和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的含量;Western blot法检测感染后肺组织NF-κB(nuclear factor-κB)通路的变化;绘制小鼠体重变化和生存曲线图。结果显示,MCMV感染模型组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润,肺组织结构破坏。青蒿琥酯(120 mg·kg^-1)治疗后的小鼠肺部炎症减轻,肺泡结构明显好转。与MCMV感染模型组相比,青蒿琥酯(120和240 mg·kg^-1)剂量组治疗后,小鼠肺部病毒复制水平降低,青蒿琥酯(120 mg·kg^-1)剂量组可显著降低促炎因子IL-6和TNF-α水平并增加抗炎因子IL-10的水平;磷酸化NF-κB蛋白表达明显下降,治疗组小鼠体重增加,生存期延长。上述结果表明,青蒿琥酯具有抑制MCMV感染小鼠肺炎的作用,通过抑制NF-κB炎症信号通路的激活,减轻肺组织炎症因子IL-6和TNF-α的释放,并增加抗炎因子IL-10的表达,从而实现减轻肺部组织炎症的作用。 王萍 陈盛 黄小桃 肖小梅 湛青平 秦爱萍 余细勇关键词:巨细胞病毒 青蒿琥酯 肺炎 炎症因子 信号通路 miR-142-3p靶向HMGB1逆转乳腺癌细胞MCF-7对阿霉素的耐药性 被引量:4 2020年 目的化疗耐药是乳腺癌复发转移、治疗效果不理想的主要因素。本文探讨miR-142-3p通过靶向高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)提高乳腺癌化疗敏感性的分子机制。方法实时荧光定量PCR检测人乳腺癌MCF-7细胞及阿霉素耐药株MCF-7/DOX细胞中的miR-142-3p水平;MTT法检测阿霉素(doxorubicin,DOX)处理后各组的增殖情况、流式细胞术检测凋亡率、Western blot检测HMGB1和自噬有关蛋白的表达水平;双荧光素酶报告实验评价miR-142-3p对HMGB1的靶向调控作用。结果阿霉素耐药株MCF-7/DOX细胞中的miR-142-3p水平明显下调。miR142-3p的过度表达增强了乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性和提高阿霉素诱导的凋亡比率。HMGB1是乳腺癌细胞中miR-142-3p的直接功能靶点,HMGB1的过表达可以明显解除由miR-142-3p上调所产生的细胞凋亡和自噬抑制。结论miR-142-3p的过表达可能通过抑制自噬靶向HMGB1,增强乳腺癌细胞对阿霉素的化学敏感性。miR-142-3p/HMGB1为提高乳腺癌对药物的敏感性提供了新的靶点,具有一定价值。 梁璐 岑慧裕 洪超 蔡晓彤 林忠晓 杜玲然 余细勇关键词:HMGB1 MCF-7 乳腺癌 阿霉素耐药 单核/巨噬细胞调控心梗后心肌纤维化的研究进展 被引量:17 2020年 急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种严重的缺血性心脏病,持续的心肌缺血可导致心肌细胞大量凋亡或坏死而丢失。心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生激剧改变,导致心脏僵硬度增加、心功能下降。MF是心肌梗死的主要病理生理学过程,可导致心脏重构(cardiac remodeling),并逐渐发展为慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)[1]。 覃宇燕 吴茜 余细勇关键词:心肌梗死 心肌纤维化 干扰素γ刺激hUC-MSCs分泌外泌体促进调节性T细胞生成 被引量:12 2017年 目的探讨生理和炎性微环境下人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)能否通过外泌体诱导调节性T细胞的生成来发挥免疫抑制功能。方法胶原酶消化法分离h UC-MSCs,应用流式细胞术鉴定h UC-MSCs。IFN-γ模拟体内炎性微环境,以未预处理为对照,分别提取外泌体,得到Nor-h UC-exo和IFN-γ-stimulated h UC-exo,分析其浓度及粒径分布等特征、并鉴定表面标记蛋白CD63的表达。采用h UC-MSCs、Nor-h UCexo、IFN-γpretreated-h UC-MSCs、IFN-γstimulated h UC-exo与人外周血单个核细胞共培养5 d后,流式细胞术检测T细胞的增殖、调节性T细胞的比例变化。结果 h UC-MSCs高表达CD73、CD44等间充质干细胞标志物。IFN-γ刺激前后外泌体粒径无明显变化,但IFN-γ刺激后分泌量和CD63增加(P<0.05)。CFSE染料示踪结果显示,h UC-MSCs来源的外泌体抑制PBMCs增殖(P<0.01),且IFN-γ刺激后明显提高外泌体的免疫抑制能力(P<0.01)。在活化T细胞中,IFN-γ-stimulated h UC-exo组Treg比例(11.53±0.88%)与IFN-γpretreated-h UC-MSCs组(7.54±0.50%)(P<0.05)、Norh UC-exo组(6.60±0.56%)(P<0.01)、对照组(3.87±0.73%)(P<0.01)相比升高。结论 h UC-MSCs可通过分泌外泌体来发挥免疫调节作用,在炎症因子刺激下h UCMSCs分泌的外泌体明显促进调节性T细胞的生成,h UC-exo可能是潜在的免疫抑制载体。 杨翔宇 李晓红 肖静 胡洁媚 冯娟 霍然 何国东 吴岳恒 余细勇关键词:脐带 外泌体 调节性T细胞 脂多糖刺激下骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对Ly6C单核巨噬细胞亚群的影响 被引量:3 2018年 目的探索炎症刺激下,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)产生的外泌体对小鼠淋巴抗原6C高表达(Ly6C^(high))单核巨噬细胞和Ly6C^(low)两个亚群比例的影响。方法梯度离心法分离BMSCs,鉴定其形态、表面标记及成脂诱导分化能力。脂多糖处理BMSCs 48h,收集上清并提取外泌体,采用Western blot法、透射电镜以及粒径分析鉴定外泌体。磁珠分选小鼠腿骨中的单核巨噬细胞,与外泌体共培养24 h后,LPS刺激48 h,流式细胞术检测Ly6C亚群变化。ELISA检测细胞上清炎症因子的变化。结果 BMSCs表达CD44、CD90等,不表达CD34、CD45,并有成脂分化能力。外泌体表达CD63,粒径大小为(82.4±3.70)nm,LPS刺激下BMSCs产生较多的外泌体(P<0.01)。与LPS组相比,外泌体可以使Ly6C^(high)单核细胞比例上升(P<0.01),Ly6C^(high)巨噬细胞比例下降(P<0.05),且LPS刺激BMSCs产生的外泌体比正常BMSCs产生的外泌体的作用更加明显(P<0.05)。促炎因子IL-6水平也明显上调(P<0.05)。结论 BMSCs产生的外泌体可以改变Ly6C^(high)单核巨噬细胞亚群比例,为BMSCs的临床治疗提供了新的靶点。 霍然 傅小媚 邓赛 林潮金 王萍 秦爱萍 杨翔宇 杨翔宇 李晓红关键词:骨髓间充质干细胞 外泌体 脂多糖 单核细胞 离体大鼠冠状动脉的分离培养及张力测定技术 被引量:9 2014年 目的建立体外培养大鼠冠状动脉和测定血管平滑肌舒缩功能的方法,为研究各种药物对血管张力的作用提供良好的血管模型.方法采用脱臼法处死SD大鼠(200~250g),取下心脏,冰浴条件下显微操作分离冠状动脉,制备成1.8~2.0mm长的血管条,置于含DMEM-F12培养基(内含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100mg·L-1链霉素)的培养皿内,在37℃,通以95%O2、5%CO2混合气的条件下培养24h后,用两根不锈钢丝穿过血管腔,固定于微血管张力测定仪的浴槽内.分别给予血管收缩剂5HT、U46619、CaCl2和血管舒张剂ACh,然后测定冠状动脉的张力变化.结果培养的冠状动脉对5-HT、U46619、CaCl2产生浓度依赖性收缩,对ACh产生浓度依赖性舒张反应.结论采用离体器官培养法培养离体的冠状动脉环,能保持血管平滑肌基本的功能,可用于各种因素对血管结构和功能影响的研究. 邝素娟 邓春玉 杨慧 饶芳 刘晓颖 张梦珍 朱杰宁 单志新 林秋雄 杨敏 余细勇关键词:冠状动脉 血管张力 血管收缩剂 血管舒张剂 扁蒴藤素抑制NCI-H1299细胞迁移侵袭的作用与机制研究 被引量:1 2020年 目的探讨扁蒴藤素对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞迁移侵袭的抑制作用及其分子机制。方法采用不同浓度(0~80μmol/L)的扁蒴藤素处理NCI-H1299细胞,CCK-8法检测细胞增殖的情况,确定扁蒴藤素对NCI-H1299细胞的非毒剂量,并以此作为后续的药效与分子机制研究剂量。划痕实验评价扁蒴藤素对NCI-H1299细胞横向迁移能力的影响;transwell迁移与侵袭实验评价扁蒴藤素对NCI-H1299细胞纵向迁移能力与侵袭能力的影响;免疫印迹法与荧光定量PCR实验分别测定上皮-间充质相关标记物蛋白与mRNA的表达水平。结果扁蒴藤素浓度<2.5μmol/L时,对NCI-H1299细胞无明显的细胞毒性。与空白对照组比较,非毒剂量的扁蒴藤素(0.5μmol/L、1.0μmol/L和2.0μmol/L)可明显抑制NCI-H1299细胞的横向迁移以及纵向的迁移与侵袭能力(P<0.01)。扁蒴藤素处理后,上皮细胞标记物E-cadherin与ZO1的表达水平明显升高,间充质细胞标记物N-caherin与Vimentin的表达水平明显降低(P<0.01)。结论扁蒴藤素具有抑制NCI-H1299细胞迁移与侵袭的能力,且这一作用可能与其调控NCI-H1299细胞的上皮-间充质转化相关。 雷雪萍 钟怡行 邓秋狄 余细勇关键词:非小细胞肺癌 肿瘤细胞迁移 肿瘤细胞侵袭 上皮-间充质转化