中央高校基本科研业务费专项资金(QN2009070)
- 作品数：8 被引量：16H指数：3
- 相关作者：范三红单丽伟张超卫晓彬王亚楠更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家科技重大专项博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 玉米脂肪酸α-双加氧酶cDNA克隆与表达分析被引量：2
- 2012年
- 以玉米自交系丹340为实验材料,同源克隆到玉米脂肪酸α-双加氧酶基因(ZmDOX)cDNA序列,并利用半定量与定量RT-PCR分析其在不同组织和PEG胁迫下的表达特征。序列分析结果表明,该cDNA序列包含1 857 bp完整的开放阅读框,编码619个氨基酸残基的蛋白产物。玉米、水稻、小麦中DOX氨基酸序列高度同源,聚集在同一进化枝,而双子叶植物存在两类DOX蛋白。组织表达特征分析发现,ZmDOX在根、茎、叶中均有表达,其中在根中表达量最高。PEG胁迫条件下,根中ZmDOX对胁迫的响应较快且增加幅度较大,而在叶中表达量有降低的趋势。
- 单丽伟张丙凯王美艳魏少华范三红
- 关键词：玉米同源克隆
- 核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析
- 2012年
- 为了建立一种核酸酶P1(Nuclease P1,NP1)的原核表达纯化系统,首先采用重叠延伸PCR将22段寡核苷酸拼接,获得人工合成的NP1基因。将其克隆至分泌型表达载体pMAL-p4X获得重组质粒pMAL-p4X-NP1,然后将重组载体转化T7 Express和Origami B(DE3)菌株诱导表达,利用Amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白MBP-NP1(Maltose binding protein-NP1)在T7 Express和Origami B(DE3)菌株中均可表达,且以可溶性形式存在。活性检测表明Origami B(DE3)菌株中获得的重组蛋白活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg);利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后,两种重组蛋白的比活力均有提高,分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。重组NP1表现出良好的热稳定性,80℃温浴30 min后重组酶仍具有90%以上的活力。2.0 mmol/L Zn2+对NP1有比较明显的激活作用,相同浓度的Cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达,为NP1纯酶的制备提供一个替代途径。
- 王亚楠魏爱云王美艳卫晓彬张超单丽伟范三红
- 关键词：核酸酶P1原核表达热稳定性
- 圆锥小麦ramosa2的克隆及其重组蛋白的DNA结合特性分析被引量：4
- 2011年
- 【目的】从四倍体圆锥小麦中克隆ramosa2(TtRa2),分析其序列特征、组织表达特异性和体外活性,为阐明ramosa2与麦类作物穗形态建成关系奠定基础。【方法】利用半定量RT-PCR分析ramosa2在不同组织中的表达水平,将其重组到pET-21a-MBP载体并在T7 Express菌株中诱导表达。利用Amylose亲和层析柱纯化重组蛋白,通过凝胶阻滞试验对其DNA特异结合能力进行鉴定。【结果】TtRA2含有LOB和RA2结构域,属于Ⅰ类LBD蛋白家族成员。TtRa2在幼穗中高丰度表达,而在根、茎、叶、种子中未检测到表达。融合的TtRA2主要以可溶性形式存在,其表达量占总蛋白的68.6%。重组TtRA2可与包含核心序列"GCGGCG"的DNA探针特异性结合,两者形成的复合体的解离常数约为10 nmol.L-1。【结论】TtRa2参与圆锥小麦穗形态建成,其编码产物具备RA2-like转录因子的典型特征,具有类似拟南芥LOB的DNA结合特性。
- 唐如春杨宇衡范三红郭蔼光
- 关键词：圆锥小麦原核表达
- 切刻核酸内切酶PNE45的原核表达与活性鉴定
- 2011年
- 【目的】对大肠杆菌噬菌体phiV10第45个基因编码蛋白PNE45进行原核表达,并检测其酶活性。【方法】设计并合成10段密码子优化的寡核苷酸序列,采用重叠延伸PCR技术,将其拼接克隆,获得人工合成的PNE45基因,然后将其整合入含有MBP纯化标签的pET21a原核表达载体中,构建重组载体pET21a-MBP-PNE45,诱导表达后获得融合蛋白MBP-PNE45。利用Amylose亲和层析纯化融合蛋白MBP-PNE45,以pUC19为底物,分别在Mg2+和Mn2+参与下对MBP-PNE45活性进行初步鉴定。【结果】融合蛋白MBP-PNE45主要以可溶性形式表达,其表达量占细胞总蛋白的35%左右。PNE45融合蛋白在Mg2+缓冲液中具有DNA随机切刻活性,在Mn2+存在时还具有切刻位点对位切刻活性。【结论】首次成功表达并制备了PNE45,并初步证明其是一种新的随机性切刻核酸酶。
- 梁亚峰张超王亚楠范三红
- 关键词：重叠延伸PCR表达纯化
- 小麦WPBF与高分子量谷蛋白基因上游Prolamin-Like box的特异结合被引量：4
- 2012年
- 【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因(HMW-GS)上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR扩增得到WPBF编码区,将其连接到pET-21a-MBP载体中,并分别在E.coliT7 Express和Origami B(DE3)菌株中诱导表达。依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,最后通过凝胶迁移阻滞试验(EMSA)对重组蛋白的DNA结合特性进行分析。【结果】在33℃的Origami B(DE3)菌株中表达含MBP和His双标签的重组WPBF大部分以可溶性形式存在,其表达量占细菌总蛋白的48.0%。重组WPBF和含HMW-GS上游Prolamin-Like box的两类DNA探针能发生特异结合,但重组WPBF和含"TGCAAAG"基序DNA探针的结合强度高于其和含"TGCAAG"基序DNA探针的结合。【结论】建立了优化的WPBF原核表达系统,并获得具有生物活性的重组蛋白;重组WPBF能与HMW-GS启动子来源的两种Prolamin-Like box特异性结合,但结合能力存在差异。
- 卫晓彬王亚楠张超单丽伟唐如春范三红
- 关键词：小麦HMW-GSBOX
- 小麦α-双加氧酶cDNA克隆及表达分析
- 2014年
- 以普通小麦陕225为材料,同源克隆小麦脂肪酸α-双加氧酶基因(TaDOX)cDNA,全面分析其基因结构、染色体定位、进化关系及蛋白结构特征,并利用实时定量RT-PCR分析其在PEG和盐胁迫下的表达模式。克隆的cDNA片段长1 854bp,编码617个氨基酸残基的小麦脂肪酸α-双加氧酶。TaDOX基因组DNA长5 529bp,位于小麦5D染色体长臂,包含10个外显子。小麦、水稻等禾本科植物α-DOX序列高度同源,聚集在同一独立进化枝,而双子叶植物存在2类DOX蛋白,聚集在另外2个分枝中。TaDOX具有脂肪酸α-双加氧酶以α-螺旋为主的空间结构特征,包含血红素结合位点及保守氨基酸His310、Thr315、Tyr378、Arg558组成的活性中心。TaDOX主要在叶和根中表达,花序和种子中也有痕量表达;叶片中TaDOX的表达在PEG和盐胁迫条件均明显下降;根中TaDOX的表达在PEG胁迫条件下无显著变化,但在盐胁迫条件下表达水平急剧升高。
- 范三红陈志刚王欣魏少华齐亚飞单丽伟
- 关键词：小麦染色体定位
- 小麦Antiquitin cDNA克隆、空间结构预测及表达谱分析被引量：1
- 2011年
- 【目的】从普通小麦中克隆Antiquitin(TaATQ)cDNA,分析其编码序列及空间结构特征,研究其在不同组织、种子发育过程及干旱和盐胁迫下的表达谱。【方法】基于EST拼接,通过RT-PCR方法克隆小麦TaATQ cDNA;通过同源建模分析TaATQ的结构特征,通过实时定量PCR研究其在不同组织和胁迫条件下的表达谱。【结果】克隆到小麦TaATQ cDNA序列1 530 bp,编码54 kD目标蛋白。TaATQ属于醛脱氢酶超家族第7家族(ALDH7),与水稻、豌豆、人、小鼠、线虫、果蝇等物种ATQ序列相似性依次为91.7%、78.1%、58.3%、58.9%、58.1%和52.5%。细胞中,功能性TaATQ可能以四聚体形式存在,每个单体由NAD+结合结构域、催化结构域、寡聚化结构域3部分构成。盐胁迫条件下叶和根中TaATQ的表达均显著升高;干旱胁迫条件下,叶中TaATQ表达显著上升,而根中TaATQ表达变化不显著。【结论】TaATQ具备醛脱氢酶家族蛋白典型结构特征,在小麦抗逆过程中起重要作用,可作为提高作物抗旱耐盐的靶基因应用于作物遗传改良。
- 范三红刘三阳李莉齐亚飞
- 关键词：小麦ANTIQUITIN结构特征
